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摘 要： 建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定化妝品中新型九肽（EQ-9）含量的方法。不同基質(zhì)類型樣品經(jīng)甲醇超聲溶解提取后，采用InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）色譜柱，以0.1%甲酸溶液和乙腈為流動相進行梯度洗脫。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，以多反應離子監(jiān)測、正離子掃描模式進行定性定量分析，外標法定量。結(jié)果表明，在最優(yōu)條件下，新型九肽的質(zhì)量濃度在2～800 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，定量限為2 ng/mL，檢出限為1 ng/mL。測定結(jié)果的相對標準偏差小于5%（n=6）；在3個質(zhì)量濃度水平下，不同基質(zhì)類型的加標平均回收率為91.0%～103%。該方法適用于不同基質(zhì)樣品中新型九肽含量的檢測，為新型九肽在化妝品中的添加及檢測提供技術(shù)支持。

 

關(guān)鍵詞： 化妝品； 新型九肽； 多肽； 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

 

多肽作為活性成分已在化妝品中廣泛應用。與蛋白質(zhì)相比，小分子生物多肽具有更高的利用率和更低的免疫原性[1]，同時兼具抗氧化、抗敏舒緩等功效，還可修復受損皮膚屏障，減輕炎癥反應[2]。皮膚是抵御外界因素入侵的第一道屏障，受臭氧層減少影響，紫外線已成為引發(fā)皮膚生理問題的重要外源因素[3]。紫外輻射會破壞皮膚穩(wěn)態(tài)，導致皮膚缺水、粗糙、產(chǎn)生皺紋及色素沉著等問題[4]，而在護膚品中添加活性多肽，可有效緩解外界因素對皮膚造成的損傷。

 

隨著計算生物學的跨越式發(fā)展，肽與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及相互作用可通過人工智能實現(xiàn)預測與模擬。間充質(zhì)干細胞分泌組中的再生分子具有多種生物學活性，主要體現(xiàn)為防止皮膚光老化、促進皮膚組織損傷的再生與修復等[5]。王飛飛等[6]從人間充質(zhì)干細胞分泌組中分離獲得 560 個肽，其分子質(zhì)量主要分布在 600~3 000 Da 之間；研究團隊通過層次統(tǒng)計力學模型篩選出 10 個具有潛在抗衰老活性的多肽，并對其進行深入表征，最終得到與三種蛋白具有強相互作用親和力且生物活性顯著的多肽 LQ-17。新型九肽（EQ-9）是通過截斷虛擬篩選候選肽 LQ-17 的 C 端結(jié)構(gòu)域合成的小分子多肽，由 9 個氨基酸組成，具有抗衰老、抗氧化、抗炎癥及氧化損傷后皮膚屏障修復等功效，不僅能修復紫外線誘導的皮膚光損傷、提高細胞活力，還可增強人表皮角質(zhì)形成細胞與人成纖維細胞的活性及細胞外基質(zhì)（ECM）分泌能力，更全面地促進真皮層細胞外基質(zhì)修護，發(fā)揮緊致抗皺作用。

 

根據(jù)王飛飛等[6]的研究結(jié)果，10 mg/L 的新型九肽即表現(xiàn)出顯著的抗氧化及抗長波紫外線（UVA）損傷活性；由于該成分在化妝品配方中的起效濃度更低，因此必須建立靈敏的分析方法對其進行定量檢測。目前多肽定量分析的方法主要有凱氏定氮法、熒光探針標記法、氨基酸分析法、高效液相色譜（HPLC）法及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法等。凱氏定氮法[7]用于測定蛋白與多肽時，存在檢測周期長、滴定過程易產(chǎn)生誤差、結(jié)果受消化程度影響較大、檢測成本高等弊端，且化妝品配方基質(zhì)復雜，其中的含氮組分會干擾測試結(jié)果準確性。熒光探針標記法具有高特異性、可視化等優(yōu)勢，但被熒光標記的多肽易受光照影響，導致信號干擾或丟失，同時標記過程可能改變多肽結(jié)構(gòu)，且該方法成本較高[8]。氨基酸分析法適用于化妝品復雜基質(zhì)中多肽的測定，不受多肽序列差異影響，尤其適用于結(jié)構(gòu)明確的合成多肽；但化妝品配方中常添加戊二醇、丁二醇、甘油等多元醇，在高溫酸水解過程中，氨基酸易與多元醇發(fā)生酯化反應，導致氨基酸檢出含量降低，進而影響檢測結(jié)果，且該方法衍生化步驟復雜，測試通量較低。高效液相色譜法具有高效、快速等特點[9]，是目前多肽檢測中應用最廣泛的分析方法，在多肽純度分析中主要用于含量檢測，但化妝品中多肽類活性物通常為微量成分，常規(guī)液相色譜法難以滿足低檢出限的檢測需求。

 

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法有效結(jié)合了液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的高分辨率優(yōu)勢[10]，憑借其高靈敏度、高特異性及多組分同步檢測的特點，已廣泛應用于化妝品功效成分定量、禁限用物質(zhì)篩查及天然植物提取物成分的定性定量分析。例如，杜遠東等[11]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測水、乳基質(zhì)化妝品中尿囊素、煙酸及煙酰胺的含量，該方法的建立可為規(guī)范企業(yè)化妝品成分標注行為提供技術(shù)支撐；周建峰等[12]采用LC-MS/MS法對精油和面膜中禁用成分歐前胡素進行定性與定量分析，有助于保障消費者健康權(quán)益及行業(yè)規(guī)范發(fā)展；潘晨等[13]采用液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法測定不同劑型化妝品中谷胱甘肽和乙酰基六肽-8的含量，擴大了該類成分的檢測范圍，為化妝品中功能肽成分的檢測提供了參考；陳意光等[14]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測護膚類產(chǎn)品中的5種棕櫚酰多肽，為化妝品中棕櫚酰肽類成分的添加與質(zhì)量控制提供了依據(jù)。由于活性多肽在化妝品中微量添加即可顯現(xiàn)功效，其實際添加量通常較低，因此建立高靈敏度的檢測方法具有重要實際意義。LC-MS/MS 法采用多反應監(jiān)測模式進行掃描，可有效降低背景基線噪音，結(jié)合質(zhì)譜特異性篩選離子對，使其在多肽定性定量分析中具備特異性強、靈敏度高等顯著優(yōu)勢，在多肽痕量分析領域可發(fā)揮重要作用[15]。筆者采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為不同基質(zhì)類型樣品中的新型九肽的檢測方法。通過對產(chǎn)品中新型九肽成分的全面方法學驗證及含量測定，為新型九肽在化妝品領域的實際應用及痕量成分分析提供理論基礎與科學依據(jù)。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀：SCIEX Triple Quad 5500+ 型，美國SCIEX公司。超高效液相色譜儀：LC-40C型，日本島津公司。電子天平： XPE105型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。超聲波清洗機：UA22MFDN型，德國維根斯公司。高速離心機：SORVALL ST 16型，美國賽默飛世爾科技有限公司。漩渦混合器：Lab Dancer型，德國艾卡公司。超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國密理博公司。甲醇、乙腈：均為質(zhì)譜級，德國默克公司。甲酸：質(zhì)譜級，羅恩科技（北京）有限公司。新型九肽對照品：肽序為ESETRILLQ，純度（質(zhì)量分數(shù)）為99.6%，相對分子質(zhì)量為1 088.2，禾美生物科技（浙江）有限公司。化妝品樣品：精華水、精華液、精華霜，為實驗室在研配方樣品。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18柱 (100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：35 ℃；進樣體積：2 μL；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈，流量為0.3 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1   梯度洗脫程序

Tab.1   Gradient elution program

 

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測（MRM）；離子化電壓：5 500 V；離子源加熱溫度： 550 ℃；氣簾氣壓力：206 kPa；噴霧氣壓力：379 kPa；輔助加熱器壓力：379 kPa；定性及定量離子對質(zhì)荷比：545.1，147.2；碰撞能量：25 eV；去簇電壓：60 V。

1.3 樣品處理

分別精密稱取適量精華水、精華液、精華霜樣品各0.02 g于10 mL具塞比色管中，加入甲醇約8 mL，渦旋30 s至樣品與提取劑混合均勻，超聲處理（功率為500 W，頻率為60 kHz）20 min，用甲醇定容至10 mL，搖勻，以10 000 r/min離心10 min，配制樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。稱取對應空白基質(zhì)樣品0.02 g，與樣品溶液制備方法同法處理，作為空白基質(zhì)提取液。

1.4 溶液配制

新型九肽標準儲備液：精密稱取新型九肽對照品10 mg，以超純水為溶劑，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液，于-20 ℃保存。新型九肽標準溶液：準確移取新型九肽標準儲備液1 mL，用體積分數(shù)為50%的甲醇溶液配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準溶液。新型九肽系列標準工作溶液：用體積分數(shù)為50%甲醇溶液配制新型九肽質(zhì)量濃度分別為2、4、10、50、100、200、400、600、800 ng/mL的系列標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 測定方法

取適量新型九肽樣品溶液和標準溶液，分別注入色譜儀中，在1.2儀器工作條件下測定，得到相應的離子對色譜峰面積，以新型九肽標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，以新型九肽定量離子對的色譜峰面積為縱坐標，繪制校準工作曲線，以外標法定量。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)新型九肽的氨基酸序列信息計算可知，新型九肽等電點為4.26，表現(xiàn)為弱酸性。為了測定新型九肽的最大響應值和最佳靈敏度，用體積分數(shù)為50%的甲醇溶液配制新型九肽的質(zhì)量濃度為500 ng/mL，用于質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。將新型九肽標準溶液通過針泵注射進質(zhì)譜儀中，采用電噴霧離子源（ESI），在正離子模式進行一級質(zhì)譜全掃描，得到新型九肽的準分子離子2價加氫離子峰[M+2H]2+的響應最大。選擇新型九肽在正離子模式下產(chǎn)生的準分子離子峰[M+2H]2+作為母離子，在多反應監(jiān)測模式下，優(yōu)化碰撞能量和去簇電壓，選擇其中響應最強的離子碎片作為定性離子和定量離子，最終結(jié)果見1.2.2 質(zhì)譜條件。

2.2 色譜條件優(yōu)化

分別比較水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L 甲酸銨溶液-乙腈為流動相體系下新型九肽的色譜行為。結(jié)果顯示，當有機相為甲醇時，因其黏度較大，導致色譜柱柱壓偏高，洗脫效果不佳；當有機相為乙腈時，色譜柱柱壓顯著下降，新型九肽色譜峰形窄、對稱性好，且保留時間提前，有效縮短了分析周期。以0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相時的峰面積為基準，分別用水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液-乙腈作為流動相，相同濃度下新型九肽色譜峰面積分別降低4.12%、4.39%、11.72%。綜合考慮目標物的響應及峰形，選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相。驗證乙腈相分別為5%、10%、16%、20%起始下新型九肽色譜行為如圖1所示。

圖1   不同乙腈相起始體積分數(shù)下新型九肽色譜圖

Fig. 1   Chromatograms of a novel nonapeptide under different volume fraction of acetonitrile phase starting conditions

從圖1可以看出，當乙腈相起始體積分數(shù)分別為5%和10%時，新型九肽保留強，殘留難以洗脫；當乙腈相體積分數(shù)為20%時，新型九肽保留較弱，且溶劑效應導致峰分裂，影響定量結(jié)果；當乙腈相起始體積分數(shù)為16%時，新型九肽色譜峰形及峰響應良好且無殘留影響，因此選擇乙腈相起始體積分數(shù)為16%。分別考察了InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18 柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國安捷倫科技有限公司），ACQUITY UPLC BEH C18 柱[100 mm× 2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技（上海）有限公司]和Zorbax SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國安捷倫科技有限公司）3種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18 柱峰形最好，不存在峰展寬和拖尾等現(xiàn)象，因此選擇InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18色譜柱。

2.3 樣品提取劑選擇

化妝品基質(zhì)種類復雜，易對檢測產(chǎn)生干擾，因此需對樣品處理的提取溶劑進行優(yōu)化。選取精華水、精華乳、精華霜3種空白基質(zhì)，制備新型九肽質(zhì)量濃度為100 ng/mL的加標樣品，分別以體積分數(shù)50%甲醇溶液、體積分數(shù)80%甲醇溶液、體積分數(shù)100%甲醇為提取劑進行篩選優(yōu)化，精華霜中新型九肽在不同溶劑中的提取回收率如圖2所示。從圖2可以看出，體積分數(shù)50%甲醇溶液及80%甲醇溶液會造成樣品乳化，離心后上層呈渾濁狀，不宜進質(zhì)譜分析，過濾導致待測成分損失，與理論值相比結(jié)果偏低；100%甲醇作為提取劑，處理樣品之后破乳完全且提取效果好，故選擇100%甲醇作為提取溶劑。

圖2   精華霜中新型九肽在不同溶劑中的提取回收率

Fig. 2   Recoveries of EQ-9 in cream matrix sample in different extraction solvents

2.4 基質(zhì)效應評價

化妝品中復雜的基質(zhì)成分會與目標物質(zhì)競爭電離，進而影響離子化效率，降低分析方法的靈敏度、精密度與準確度。一般采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法進行分析，并對基質(zhì)效應進行監(jiān)控與消除[16]，選取的化妝品基質(zhì)為精華水、精華液和精華霜，考察新型九肽在3種基質(zhì)中的基質(zhì)效應。移取適量新型九肽標準溶液，分別用100%甲醇和精華水、精華液、精華霜3種不同基質(zhì)提取液配制質(zhì)量濃度分別為2、100、400 ng/mL的標準溶液進樣分析，樣品中目標成分新型九肽的基質(zhì)效應按照式（1）進行計算[17]：

EM =  ×100%

（1）

式中：EM——新型九肽的基質(zhì)效應；A——不同基質(zhì)提取液配制的標準溶液中的新型九肽峰面積；B——甲醇配制的標準溶液中新型九肽的峰面積；若80%＜EM＜120%，則基質(zhì)效應對結(jié)果影響可以忽略；若EM＜80%或EM＞120%，說明存在基質(zhì)效應且影響測試結(jié)果，需采用合適方法消除。目前基質(zhì)效應的優(yōu)化方法一般為優(yōu)化樣品處理、優(yōu)化分離梯度和基質(zhì)匹配標準溶液進行消除等［18］。根據(jù)公式（1）計算不同類型基質(zhì)對新型九肽的基質(zhì)效應，結(jié)果見表2。

表2   新型九肽的基質(zhì)效應

Tab. 2   Matrix effects of EQ-9

 

由表2可知，精華水、精華液、精華霜中基質(zhì)對新型九肽的基質(zhì)效應范圍分別為90.9%～95.3%、94.4%～103.7%、92.2%～99.5%，說明基質(zhì)效應對新型九肽的影響不大，該方法適用于液態(tài)精華水、精華乳及精華霜基質(zhì)中新型九肽含量的檢測。

2.5 線性關(guān)系

將新型九肽系列標準工作溶液按質(zhì)量濃度由低到高依次上機檢測，在1.2儀器工作條件下測定各濃度對應的峰面積。以新型九肽的質(zhì)量濃度為橫坐標（x），對應的峰面積為縱坐標（y），采用權(quán)重系數(shù) 1/x² 進行線性回歸分析，繪制標準工作曲線，并計算線性方程為y=11 600 x-1 600，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，表明新型九肽的質(zhì)量濃度在2～800 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.6 檢出限與定量限

在不同類型基質(zhì)樣品中添加新型九肽，按照1.4方法制備樣品，在1.2儀器工作條件下上機測定，觀察新型九肽色譜圖，以信噪比（S/N）分別為3和10的質(zhì)量濃度作為其檢出限和定量限，根據(jù)取樣質(zhì)量和定容體積，換算成樣品中的含量，以質(zhì)量濃度表示，計算得新型九肽的檢出限為1 ng/mL，定量限為2 ng/mL。

2.7 精密度試驗

取精華水、精華乳、精華霜基質(zhì)空白樣品，分別配制新型九肽終質(zhì)量濃度為10 ng/mL的樣品溶液各6份，在1.2儀器工作條件下上機測定，考察樣品配制及儀器測定誤差，試驗結(jié)果見表3。依據(jù)《中華人民共和國藥典》2020 年版四部 9101 分析方法驗證指導原則，當測量值的相對標準偏差（RSD）均小于 6% 時，表明方法重復性良好。

表3   精密度試驗結(jié)果

Tab. 3   Precision test results

 

由表3可知，測定結(jié)果的相對標準偏差為4.1%~4.4%，說明該方法精密度較好，適用于新型九肽的測定。

2.8 樣品加標回收試驗

分別精密稱取上述3種空白基質(zhì)各0.02 g于10 mL具塞比色管中，分別加入新型九肽標準溶液，用甲醇定容至標線，使新型九肽的終濃度分別為 1、50、200 倍定量限。渦旋混勻后，超聲提取 20 min，取出，放置至室溫，以1 000 r/min 離心10 min，取上清液。每個質(zhì)量濃度平行測定6份，在1.2儀器工作條件下上機測定，試驗結(jié)果見表4。由表4可知，新型九肽在精華水、精華液、精華霜的平均回收率分別為91.0%～95.4%、95.5%～103%、93.1%～99.6%，表明該方法準確度較高。

表4   新型九肽在不同基質(zhì)樣品中的平均回收率(n=6)

Tab. 4   The results of EQ-9 in addition recovery in different cosmetic formulations (n=6)

 

2.9 實際樣品測定

采用最優(yōu)條件下的試驗方法，對不同基質(zhì)樣品中的新型九肽含量進行測定，樣品測試結(jié)果見表5。由表5可知，不同基質(zhì)類型產(chǎn)品中不同添加量測試結(jié)果與理論添加量差異不大，測定結(jié)果的相對標準偏差均小于2%；當添加量僅為0.000 5%時，測試結(jié)果與理論含量一致。不同基質(zhì)中新型九肽測試圖譜見圖3。從圖3可以看出，3種基質(zhì)樣品中新型九肽出峰時間與標準物質(zhì)保持一致。該方法適用于不同基質(zhì)類型化妝品中新型九肽的痕量分析。

表5   不同基質(zhì)產(chǎn)品中新型九肽含量

Tab. 5   The content of EQ-9 in different cosmetic formulations（n=3）

 

圖3   不同基質(zhì)樣品中新型九肽組分色譜圖

Fig. 3   The chromatogram of EQ-9 components in different cosmetic formulations t/min

1—標準物質(zhì)； ；2—精華水； 3—精華液； 4—精華霜

 

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測不同基質(zhì)類型化妝品中的新型九肽含量的方法。該方法在現(xiàn)有檢測技術(shù)基礎上，進一步擴大了目標化合物的檢測范圍，且具備樣品處理簡便、分析快速、靈敏度高、專屬性強的優(yōu)勢。對所建方法進行完整的方法學驗證，證明線性范圍、檢出限及定量限濃度、精密度、回收率等技術(shù)指標均滿足實際檢測要求。采用該方法對3款不同劑型化妝品中不同添加量的新型九肽共11個樣品進行測定，測試結(jié)果與理論添加值均相符。該方法的建立，為化妝品中新型九肽等活性多肽的添加控制及痕量分析提供了可靠的檢測依據(jù)。

 

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17 曹梅榮，馬俊美，王娟，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中10種生物堿［J］.色譜，2019，37（9）： 977.
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