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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2026-04-28 22:06
作者：蔣晨晨，黃瑛，宋捷，文海若
中國食品藥品檢定研究院安全評(píng)價(jià)研究所；
藥品監(jiān)管科學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
摘要：
寡核苷酸藥物為一類短鏈核苷酸序列藥物，可通過調(diào)控基因表達(dá)或干擾特定RNA功能發(fā)揮靶向治療作用。因其具備特異性高、靶向能力強(qiáng)的特點(diǎn)，在基因調(diào)控、疾病治療和藥物遞送等方面展現(xiàn)出巨大潛力。寡核苷酸藥物與基因組的序列特異性相互作用可能引發(fā)非靶基因雜交，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常，因其化學(xué)修飾和作用機(jī)制存在特殊性，傳統(tǒng)遺傳毒性評(píng)價(jià)方法面臨挑戰(zhàn)。因此，本文對(duì)寡核苷酸藥物遺傳毒性的潛在作用機(jī)制、分級(jí)評(píng)價(jià)策略和組合試驗(yàn)方法及相關(guān)監(jiān)管要求進(jìn)行了綜述。
關(guān)鍵詞：寡核苷酸；遺傳毒性；安全性評(píng)價(jià)；靶向治療
正文
寡核苷酸藥物(oligonucleotides therapeutics，ONTs)為一類短鏈核苷酸序列藥物，可通過調(diào)控基因表達(dá)或干擾特定RNA功能靶向發(fā)揮療效，是當(dāng)前藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。因其具備特異性高、靶向能力強(qiáng)的特點(diǎn)，在基因調(diào)控、疾病治療和藥物遞送等方面展現(xiàn)出巨大潛力，為傳統(tǒng)方法難以治愈的疾病，如罕見病、腫瘤、代謝性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的治療策略。近年來，隨著ONTs研發(fā)進(jìn)程的加速，其體內(nèi)安全性也受到高度關(guān)注?；诮Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這類小分子生物制品可能在體內(nèi)與非目標(biāo)序列發(fā)生雜交，因而存在脫靶效應(yīng)、致突變性甚至致癌性風(fēng)險(xiǎn)。例如，曾用于治療家族性高膽固醇血癥的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)藥物Mipomersen，在臨床應(yīng)用中導(dǎo)致丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平升高，在12%患者中≥3倍正常上限，9%的患者中≥5倍正常上限，伴隨肝脂肪變性，并引發(fā)了對(duì)其長期致癌性的關(guān)注，最終因不可接受風(fēng)險(xiǎn)退市。
遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，是藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)及上市的重要環(huán)節(jié)。為此，以寡核苷酸安全工作組(Oligonucleotide Safety Working Group，OSWG)為代表的國際組織已發(fā)布ONTs開展非臨床遺傳毒性評(píng)價(jià)的相關(guān)建議。
基于此，本文綜合國際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(International Council for Harmonisation，ICH)、美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)及OSWG等機(jī)構(gòu)的指南要求，對(duì)ONTs的遺傳毒性作用機(jī)制、適宜的評(píng)價(jià)策略和試驗(yàn)方法及相關(guān)監(jiān)管要求進(jìn)行綜述，探討其安全性評(píng)價(jià)的科學(xué)性與挑戰(zhàn)，以期為ONTs藥物研發(fā)提供參考。
1、ONTs的類型、作用機(jī)制及特點(diǎn)
1.1 ONTs藥物類型及作用機(jī)制
ONTs包括ASO、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、核酸適配體(aptamer)等。不同類型ONTs在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制見表1。
ONTs的作用機(jī)制以核酸序列互補(bǔ)配對(duì)或特異性結(jié)合為核心。ASO通過與靶mRNA結(jié)合，招募核糖核酸酶H(RNase H)切割靶mRNA或通過空間位阻效應(yīng)，干擾mRNA的剪接與轉(zhuǎn)運(yùn)等過程；siRNA進(jìn)入細(xì)胞后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex，RISC)，特異性識(shí)別并切割互補(bǔ)靶mRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的抑制；miRNA通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA翻譯或促使其降解，參與基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控；核酸適配體通過特異性折疊與靶蛋白高親和力結(jié)合，干擾蛋白的功能并干預(yù)相關(guān)生物學(xué)過程；誘餌寡核苷酸模擬DNA結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子或蛋白復(fù)合物；免疫刺激寡核苷酸可激活Toll樣受體(TLR)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答；mRNA則通過遞送編碼功能蛋白的核酸序列至細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)目標(biāo)蛋白發(fā)揮治療作用。
1.2 ONTs藥物的特點(diǎn)
ONTs的核心優(yōu)勢(shì)在于高度特異性，能夠精準(zhǔn)靶向特定核酸序列或蛋白，高效干預(yù)疾病相關(guān)的分子通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因或蛋白的精準(zhǔn)調(diào)控。然而，未經(jīng)修飾的ONTs存在體內(nèi)穩(wěn)定性差、易被核酸酶降解、血漿蛋白結(jié)合能力弱、半衰期短及細(xì)胞攝取效率低等缺陷，嚴(yán)重影響其靶組織分布和藥效發(fā)揮。為解決上述問題，通常通過化學(xué)修飾提升其穩(wěn)定性、靶向性和藥理活性，常用修飾方式包括硫代磷酸酯(phosphorothioate，PS)、2′-O-甲基(2′-O-methyl，2′-O-Me)、2′-甲氧基乙基(2′O-methoxyethyl，2′-MOE)及2′-氟代(2′-fluoro，2′-F)修飾等。
2、ONTs的潛在遺傳毒性作用機(jī)制
ONTs的潛在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)主要源于化學(xué)修飾、代謝過程及遞送載體等方面，其作用機(jī)制可分為直接損傷與間接干擾兩大類，風(fēng)險(xiǎn)水平與化學(xué)修飾類型、代謝產(chǎn)物特性及作用模式密切相關(guān)。
2.1 直接遺傳毒性機(jī)制
直接遺傳毒性機(jī)制指ONTs或其代謝產(chǎn)物直接與基因組DNA發(fā)生相互作用，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)或復(fù)制過程異常，主要包括修飾單體整合與DNA復(fù)制錯(cuò)誤、三鏈體形成與局部DNA損傷兩種方式。
2.1.1 修飾單體整合與DNA復(fù)制錯(cuò)誤
ONTs進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)代謝會(huì)釋放部分化學(xué)修飾的核苷單體，典型如2′-氟尿苷(2′-FU)、2′-氟胞苷(2′-FC)等。這些修飾單體可被細(xì)胞內(nèi)的激酶催化磷酸化，轉(zhuǎn)化為具有活性的核苷酸形式，進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性摻入正在復(fù)制的DNA鏈中。這種異常摻入可能引發(fā)兩種關(guān)鍵問題：一是導(dǎo)致DNA鏈合成終止，因?yàn)樾揎椇塑账岬幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與天然核苷酸存在差異，可能破壞DNA聚合酶的延伸功能；二是引發(fā)堿基錯(cuò)配，如修飾單體與天然堿基的配對(duì)特異性改變，導(dǎo)致DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)G：C→A：T等突變類型。
研究表明，2′-FC單體在細(xì)菌回復(fù)突變(Ames)試驗(yàn)中對(duì)大腸桿菌WP2uvrA菌株呈陽性反應(yīng)，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)中為陰性。造成這種差異的核心原因可能是，大腸桿菌缺乏哺乳動(dòng)物細(xì)胞特有的錯(cuò)配修復(fù)通路和堿基切除修復(fù)通路，無法有效識(shí)別并清除摻入DNA鏈中的修飾單體，導(dǎo)致突變不斷積累；而哺乳動(dòng)物細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)可高效識(shí)別異常摻入的修飾單體，將其從DNA鏈中切除并修復(fù)，從而降低突變風(fēng)險(xiǎn)。
2.1.2 三鏈體形成與局部DNA損傷
三鏈體形成是指ONTs的特定序列與基因組DNA的雙鏈區(qū)域結(jié)合，形成DNA-ONTs三鏈復(fù)合物的過程。這一過程需滿足嚴(yán)格的序列條件：ONTs序列中需包含不少于12個(gè)連續(xù)的嘌呤或嘧啶堿基，且靶DNA對(duì)應(yīng)區(qū)域需為多嘌呤/多嘧啶重復(fù)結(jié)構(gòu)，二者通過Hoogsteen氫鍵或反Hoogsteen氫鍵實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合。
理論上，三鏈體的形成可能通過兩種方式干擾DNA功能：一是物理性阻礙DNA聚合酶、RNA聚合酶等酶類與DNA的結(jié)合，抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程；二是導(dǎo)致局部DNA結(jié)構(gòu)扭曲，誘發(fā)DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而引發(fā)染色體畸變。但在生理?xiàng)l件下，這種風(fēng)險(xiǎn)實(shí)際發(fā)生概率極低。一方面，生理pH值和離子強(qiáng)度會(huì)顯著降低三鏈體的穩(wěn)定性，使其難以持續(xù)存在；另一方面，基因組DNA通常與組蛋白等形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，緊密的包裝方式會(huì)阻礙ONTs與靶DNA區(qū)域的結(jié)合。因此，OSWG建議，可通過生物信息學(xué)序列分析排查ONTs是否存在符合三鏈體形成條件的序列，若不存在則無需開展專門的試驗(yàn)評(píng)價(jià)。
2.2 間接遺傳毒性機(jī)制
間接遺傳毒性機(jī)制指ONTs不直接與DNA相互作用，而是通過干擾DNA修復(fù)通路、引發(fā)炎癥反應(yīng)等間接方式，增加DNA損傷風(fēng)險(xiǎn)，主要包括補(bǔ)體激活與炎癥介導(dǎo)的DNA損傷、DNA修復(fù)通路干擾兩種類型。
2.2.1 補(bǔ)體激活與炎癥介導(dǎo)的DNA損傷
部分ONTs的化學(xué)修飾基團(tuán)或遞送載體進(jìn)入體內(nèi)后，可能激活機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)是先天免疫的重要組成部分，其過度激活會(huì)引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，釋放大量炎癥因子，包括白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等。這些炎癥因子會(huì)通過多種途徑間接損傷DNA：一是誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，ROS作為強(qiáng)氧化性物質(zhì)，可攻擊DNA鏈中的堿基和脫氧核糖骨架，導(dǎo)致堿基氧化修飾、DNA單鏈斷裂甚至雙鏈斷裂；二是干擾DNA修復(fù)酶的活性，抑制損傷DNA的修復(fù)進(jìn)程，導(dǎo)致?lián)p傷累積。研究顯示，PS修飾的ONTs在恒河猴體內(nèi)給藥后，可觸發(fā)替代補(bǔ)體途徑激活，導(dǎo)致短暫性低血壓等急性毒性反應(yīng)。盡管該研究未直接檢測(cè)到DNA損傷，但炎癥反應(yīng)引發(fā)的ROS蓄積已被證實(shí)是多種藥物間接遺傳毒性的重要介導(dǎo)途徑。這種間接損傷具有明顯的組織特異性和劑量依賴性，通常在高劑量給藥或長期暴露情況下才會(huì)顯現(xiàn)。
2.2.2 DNA修復(fù)通路干擾
部分化學(xué)修飾的ONTs可通過干擾DNA修復(fù)相關(guān)蛋白的功能，間接增加DNA損傷風(fēng)險(xiǎn)。其中，2′-F修飾的硫代磷酸酯是ONTs的典型代表。研究發(fā)現(xiàn)，這類ONTs轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可通過蛋白酶體依賴的降解途徑，顯著降低P54nrb和PSF蛋白的表達(dá)水平。P54nrb和PSF是DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白，二者形成復(fù)合物參與非同源末端連接修復(fù)通路，能夠精準(zhǔn)識(shí)別DNA斷裂位點(diǎn)并招募其他修復(fù)因子。當(dāng)這兩種蛋白表達(dá)降低時(shí)，DNA雙鏈斷裂的修復(fù)效率會(huì)顯著下降，導(dǎo)致?lián)p傷在細(xì)胞內(nèi)累積，進(jìn)而增加染色體畸變和基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。而且這種修復(fù)通路干擾作用具有一定的普遍性，在人、小鼠、大鼠等不同物種的多種細(xì)胞類型中均可觀察到，且與ONTs的具體序列、2′-F修飾的位置、遞送方法及作用機(jī)制無關(guān)。
此外，不同類型ONTs及化學(xué)修飾方式會(huì)改變其細(xì)胞內(nèi)代謝途徑與代謝產(chǎn)物，部分代謝產(chǎn)物可能具有潛在遺傳毒性，但由于這類代謝產(chǎn)物難以精準(zhǔn)追蹤與檢測(cè)，給遺傳毒性評(píng)價(jià)帶來技術(shù)難題。同時(shí)，ONTs的細(xì)胞攝取依賴脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticle，LNP)等載體或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，而細(xì)菌缺乏相應(yīng)攝取系統(tǒng)，導(dǎo)致傳統(tǒng)Ames試驗(yàn)難以反映其體內(nèi)真實(shí)暴露水平，且ONTs分子量大、帶負(fù)電荷的特性使其細(xì)胞膜通透性較差，細(xì)胞攝取效率低，可能導(dǎo)致傳統(tǒng)遺傳毒性試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
綜上，ONTs遺傳毒性作用的直接機(jī)制主要與代謝釋放的修飾單體相關(guān)，核心是異常摻入DNA引發(fā)復(fù)制錯(cuò)誤或形成三鏈體干擾DNA功能，但生理?xiàng)l件下三鏈體形成風(fēng)險(xiǎn)極低；間接機(jī)制則主要源于化學(xué)修飾(如PS、2′-F)或載體(如陽離子脂質(zhì))引發(fā)的下游效應(yīng)，包括炎癥介導(dǎo)的ROS損傷和DNA修復(fù)通路抑制，這類機(jī)制的發(fā)生通常與ONTs的體內(nèi)暴露劑量、組織分布及物種差異密切相關(guān)。不同機(jī)制之間可能存在協(xié)同作用。炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的ROS會(huì)增加DNA損傷，而DNA修復(fù)通路的抑制會(huì)進(jìn)一步加劇損傷累積，最終顯著提升遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。明確這些機(jī)制不僅有助于解釋不同類型ONTs的遺傳毒性差異，也為制定針對(duì)性的評(píng)價(jià)策略提供了科學(xué)依據(jù)，比如針對(duì)2′-F修飾的ONTs，需重點(diǎn)關(guān)注DNA修復(fù)通路相關(guān)指標(biāo)。
3、遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)評(píng)價(jià)策略
3.1 相關(guān)非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則
目前已上市的ONTs遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，常規(guī)觀點(diǎn)認(rèn)為其遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)較低。但新型ONTs仍需開展遺傳毒性試驗(yàn)，以規(guī)避臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)。部分已上市ONTs藥物開展的遺傳毒性試驗(yàn)見表2。
《生物技術(shù)藥物的臨床前安全性評(píng)價(jià)》指導(dǎo)原則可作為臨床前安全性評(píng)價(jià)的參考依據(jù)，但由于未經(jīng)修飾的ONTs成藥性差，目前ONTs多為化學(xué)合成產(chǎn)物，其臨床前安全性評(píng)價(jià)主要遵循小分子藥物監(jiān)管指南。其中，遺傳毒性評(píng)價(jià)參照ICH S2R1《人用藥物遺傳毒性試驗(yàn)和結(jié)果分析指導(dǎo)原則》。即使基因突變并非ONTs主要遺傳毒性作用機(jī)制，OSWG仍建議開展ONTs基因突變?cè)囼?yàn)。已有研究顯示，含PS修飾的ASO藥物Mipomersen的Ames試驗(yàn)、體外染色體畸變?cè)囼?yàn)和體內(nèi)微核試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，證明化學(xué)修飾未增加其遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。
2020年3月，日本藥品和醫(yī)療器械管理局(Pharmaceuticals and Medical Devices Agency，PMDA)發(fā)布《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》，明確僅由天然核苷酸組成的ONTs無需進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)。2024年11月，F(xiàn)DA發(fā)布《寡核苷酸治療產(chǎn)品的非臨床安全性評(píng)價(jià)指南草案》。PMDA和FDA的指南均認(rèn)為僅由天然核苷酸組成的ONTs無需進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)。OSWG也認(rèn)為天然存在于人體內(nèi)未經(jīng)修飾、僅含天然堿基或已充分測(cè)試的化學(xué)修飾(PS、2′-MOE、2′-O-Me等)的ONTs無需進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)。對(duì)于含有新型化學(xué)成分修飾的非天然ONTs則建議進(jìn)行傳統(tǒng)的遺傳毒性試驗(yàn)，并且建議使用完整的產(chǎn)品制劑(包括連接子、結(jié)合物和脂質(zhì)體)進(jìn)行試驗(yàn)，以提供最具臨床相關(guān)性的評(píng)估數(shù)據(jù)，不同機(jī)構(gòu)和組織的核心要求見表3。
3.2 推薦的遺傳毒性試驗(yàn)組合
OSWG指出，ONTs代謝過程中化學(xué)修飾的單核苷酸可能釋放并摻入基因組DNA，染色體損傷是ONTs遺傳毒性臨床前安全性評(píng)價(jià)的核心。OSWG推薦采取以下試驗(yàn)組合來評(píng)價(jià)ONTs的遺傳毒性：①一項(xiàng)檢測(cè)染色體損傷的體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)(體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)等)；②一項(xiàng)檢測(cè)基因突變的哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)；③一項(xiàng)檢測(cè)染色體損傷的體內(nèi)試驗(yàn)(嚙齒動(dòng)物骨髓微核試驗(yàn)等)。
對(duì)于含有新型化學(xué)修飾或遞送載體的ONTs，其化學(xué)組成部分需參照ICH S2(R1)指南進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，建議試驗(yàn)中通過定量或定性的方法證明靶細(xì)胞對(duì)ONTs的攝取情況。體外試驗(yàn)應(yīng)納入代謝活化系統(tǒng)，以評(píng)估非寡核苷酸成分的代謝產(chǎn)物的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。
3.3 遺傳毒性評(píng)價(jià)
3.3.1 細(xì)胞攝取的證據(jù)支撐
不同試驗(yàn)體系與化學(xué)修飾會(huì)影響ONTs的細(xì)胞攝取效率，建議采用放射性或熒光標(biāo)記等方法證明細(xì)胞對(duì)ONTs的攝取能力。PS修飾ONTs可通過高濃度被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，而LNP包裹ONTs需驗(yàn)證載體介導(dǎo)的攝取。
3.3.2 代謝產(chǎn)物與雜質(zhì)評(píng)價(jià)
需通過體內(nèi)試驗(yàn)或體外代謝模擬模型評(píng)價(jià)ONTs代謝產(chǎn)物的潛在遺傳毒性。若合成工藝中存在含DNA反應(yīng)性結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物等工藝雜質(zhì)，則需參照ICH M7(R2)《評(píng)估和控制藥物中的DNA活性(致突變)雜質(zhì)以限制潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)》進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
3.3.3 三鏈體形成風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
三鏈體形成風(fēng)險(xiǎn)無需開展專門的試驗(yàn)評(píng)價(jià)，可通過生物信息學(xué)分析序列比較進(jìn)行評(píng)估。若ONTs序列中含有不少于12個(gè)連續(xù)嘌呤/嘧啶序列，通常需與監(jiān)管機(jī)構(gòu)溝通討論，進(jìn)一步明確風(fēng)險(xiǎn)水平。
綜上，寡核苷酸藥物的分級(jí)評(píng)價(jià)流程見圖1。
4、當(dāng)前遺傳毒性評(píng)價(jià)體系的局限性
4.1 試驗(yàn)方法的內(nèi)在缺陷
傳統(tǒng)Ames試驗(yàn)依賴細(xì)菌體系，但PS修飾或LNP包裹的ONTs難以穿透細(xì)菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致試驗(yàn)易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。FDA指南指出，部分細(xì)菌菌株在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下無法充分?jǐn)z取ONTs，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果無意義；若確認(rèn)ONTs無法被試驗(yàn)菌株攝取，應(yīng)改用體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)進(jìn)行評(píng)估。此外，二維細(xì)胞系無法模擬體內(nèi)組織分布特性，且缺乏免疫微環(huán)境，可能低估炎癥相關(guān)的間接遺傳毒性。
4.2 物種差異與人類特異性風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)度不高
盡管非人靈長類與人類核苷酸序列高度保守，但人類特異性脫靶效應(yīng)(包括三鏈DNA形成)難以在動(dòng)物模型中預(yù)測(cè)。ONTs與人類基因組中特定多嘌呤序列的潛在結(jié)合，可能因嚙齒類動(dòng)物的序列差異而無法檢出。嚙齒類動(dòng)物腎臟對(duì)PS-ONTs的蓄積敏感性顯著高于人類，可能導(dǎo)致毒性評(píng)估結(jié)果出現(xiàn)偏差，類似大鼠腎毒性與人類臨床結(jié)果無相關(guān)性的案例已有報(bào)道。
4.3 新型修飾與遞送系統(tǒng)的挑戰(zhàn)
橋接核酸和納米技術(shù)等新型修飾的長期代謝產(chǎn)物是否會(huì)摻入DNA尚未明確，現(xiàn)有測(cè)試僅依賴短期體外試驗(yàn)，缺乏慢性暴露數(shù)據(jù)支持。LNP、N-乙酰半乳糖胺偶聯(lián)物可能改變ONTs的細(xì)胞內(nèi)分布特性，傳統(tǒng)微核試驗(yàn)難以全面評(píng)估載體介導(dǎo)的間接損傷。
4.4 機(jī)制特異性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)不足
現(xiàn)有指南依賴生物信息學(xué)預(yù)測(cè)排除≥12個(gè)連續(xù)嘌呤/嘧啶序列的ONTs三鏈體形成風(fēng)險(xiǎn)，但短序列ONTs的潛在結(jié)合尚未被系統(tǒng)研究，且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估工具。CpG寡核苷酸或陽離子脂質(zhì)引發(fā)的慢性炎癥可能通過TNF-α等細(xì)胞因子間接誘導(dǎo)DNA突變，TNF-α作為關(guān)鍵炎癥因子，可通過激活JNK信號(hào)通路、抑制線粒體復(fù)合物Ⅲ引發(fā)ROS蓄積等機(jī)制，增強(qiáng)DNA單鏈斷裂、微核形成等遺傳損傷風(fēng)險(xiǎn)，且這一過程可能與NF-κB通路介導(dǎo)的炎癥放大效應(yīng)相關(guān)[21，33-34]。但當(dāng)前遺傳毒性試驗(yàn)體系未納入炎癥通路激活及ROS生成等相關(guān)指標(biāo)，無法全面評(píng)估這類間接遺傳毒性。同時(shí)，體內(nèi)微核試驗(yàn)等體內(nèi)模型雖能更真實(shí)反映藥物在體內(nèi)的遺傳毒性，但結(jié)果受動(dòng)物個(gè)體差異影響，且存在成本高、周期長的局限性。
5、未來評(píng)價(jià)技術(shù)方向
傳統(tǒng)二維細(xì)胞系難以模擬肝細(xì)胞等組織的特異性攝取機(jī)制，可引入三維類器官模型更精確地評(píng)估ONTs誘導(dǎo)的DNA損傷；單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可分析單細(xì)胞基因組突變譜，替代傳統(tǒng)群體水平檢測(cè)，提升檢測(cè)靈敏度；γ-H2AX焦點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)對(duì)DNA雙鏈斷裂的定量靈敏度高于體外染色體畸變?cè)囼?yàn)，可作為遺傳毒性的早期檢測(cè)指標(biāo)。
5.1 生物標(biāo)志物的開發(fā)與應(yīng)用
生物標(biāo)志物作為反映生物體生理病理狀態(tài)或外源物質(zhì)效應(yīng)的分子指標(biāo)，在遺傳毒性早期預(yù)警中具有關(guān)鍵作用。其開發(fā)需滿足敏感性、特異性及臨床可及性原則，通過篩選與DNA損傷、修復(fù)相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物，γ-H2AX、8-羥基脫氧鳥苷和DNA修復(fù)基因表達(dá)水平均是重要候選指標(biāo)，為ONTs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)工具。
5.2 計(jì)算毒理學(xué)與多組學(xué)技術(shù)整合
5.2.1 人工智能(artificial intelligence，AI)輔助毒性預(yù)測(cè)
ONTs與基因組的序列特異性相互作用可能引發(fā)非靶基因雜交，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常及潛在遺傳毒性。由于生物體內(nèi)基因網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，傳統(tǒng)方法難以全面評(píng)估脫靶風(fēng)險(xiǎn)，而人工智能技術(shù)的發(fā)展為解決這一問題提供了高效工具，典型平臺(tái)及應(yīng)用如下：①DeepTox：由德國馬普研究所開發(fā)的深度學(xué)習(xí)模型，基于海量化合物的毒性數(shù)據(jù)訓(xùn)練，可通過分析ONTs的化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其遺傳毒性潛力，尤其擅長預(yù)測(cè)基因突變和染色體損傷風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)85%以上；②Tox21：由美國國立衛(wèi)生研究院牽頭建立的高通量篩選平臺(tái)，整合了機(jī)器學(xué)習(xí)算法與體外毒理學(xué)數(shù)據(jù)，可快速評(píng)估ONTs及其代謝產(chǎn)物對(duì)DNA修復(fù)通路、炎癥通路的干擾作用，已被用于多種核酸類藥物的早期毒性篩選；③DeepSEA：基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的序列分析工具，可通過全基因組序列比對(duì)，預(yù)測(cè)ONTs與基因組DNA的潛在結(jié)合位點(diǎn)(包括三鏈體形成位點(diǎn))，精準(zhǔn)識(shí)別脫靶風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，為ONTs的序列優(yōu)化提供參考。
5.2.2 多組學(xué)技術(shù)的協(xié)同應(yīng)用
在毒性評(píng)價(jià)階段，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)可系統(tǒng)識(shí)別藥物處理后的分子擾動(dòng)網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可分析DNA損傷響應(yīng)基因及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)變化；蛋白質(zhì)組學(xué)可揭示DNA修復(fù)蛋白及炎癥因子的表達(dá)差異；代謝組學(xué)可追蹤ONTs的代謝產(chǎn)物及ROS等毒性介質(zhì)的生成情況。通過整合多組學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合對(duì)照寡核苷酸序列的差異分析，可精準(zhǔn)驗(yàn)證脫靶效應(yīng)與遺傳毒性的關(guān)聯(lián)性，為機(jī)制研究提供全面的分子證據(jù)。
6、結(jié)論與展望
ONTs的遺傳毒性評(píng)價(jià)策略科學(xué)性直接影響臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。盡管多數(shù)傳統(tǒng)修飾ONTs的遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果為陰性，但新型結(jié)構(gòu)與復(fù)雜制劑的潛在風(fēng)險(xiǎn)仍需謹(jǐn)慎評(píng)估。鑒于ONTs結(jié)構(gòu)的多樣性與作用機(jī)制的特殊性，需結(jié)合其化學(xué)修飾、遞送系統(tǒng)及代謝特征“定制”相應(yīng)的遺傳毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)組合。
未來研究應(yīng)聚焦在多技術(shù)整合與監(jiān)管框架優(yōu)化，在技術(shù)層面，進(jìn)一步推進(jìn)器官芯片、AI預(yù)測(cè)模型及多組學(xué)分析的深度融合，提升遺傳毒性評(píng)價(jià)的效率與準(zhǔn)確性；在監(jiān)管層面，需基于ONTs的作用機(jī)制特點(diǎn)，完善分級(jí)評(píng)價(jià)指南，明確試驗(yàn)豁免的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，減少不必要的動(dòng)物試驗(yàn)。通過技術(shù)創(chuàng)新與監(jiān)管協(xié)同，為ONTs的安全研發(fā)與臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)支撐。
來源：癌變·畸變·突變
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