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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2026-05-06 21:53
摘要：
建立一種高效凝膠過(guò)濾色譜-電噴霧式檢測(cè)器（CAD）法測(cè)定蘆薈多糖重均分子質(zhì)量。將蘆薈多糖分離純化，采用phenomenex PolySep-GFC-P4000色譜柱（30 m×7.8 mm，5 μm），以10 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為30 μL，采用CAD檢測(cè)器測(cè)定，測(cè)定溫度為25 ℃。蘆薈多糖分子質(zhì)量在180~410 000 Da范圍內(nèi)與色譜峰保留時(shí)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.990。測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%（n=6），樣品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，測(cè)定值和理論值的相對(duì)誤差為1.58%（n=6）。該方法適用于蘆薈多糖重均分子質(zhì)量的測(cè)定。
關(guān)鍵詞： 蘆薈多糖； 重均分子質(zhì)量； 高效凝膠過(guò)濾色譜法； 電噴霧檢測(cè)器
蘆薈為百合科蘆薈屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物，是應(yīng)用廣泛的天然植物資源。蘆薈屬包含300 余個(gè)品種，其中庫(kù)拉索蘆薈是最具種植與應(yīng)用價(jià)值的常用品種，也是目前研究最為深入、市場(chǎng)銷(xiāo)量最高的蘆薈種類(lèi)[1-2]。目前，蘆薈已被作為原料或添加劑廣泛應(yīng)用于保健食品、護(hù)膚品、醫(yī)藥用品領(lǐng)域。外用時(shí)，蘆薈葉可促進(jìn)傷口愈合、抑菌、消炎、防止皮膚老化等，也可作為保濕劑和皮膚科用品[3]。其中，蘆薈多糖是蘆薈凝膠中的主要活性物質(zhì)，具有保護(hù)炎癥損傷、抗腫瘤、抑菌、抗衰老、抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞再生、提高免疫力等功效[4-7]。蘆薈多糖組分為葡甘露聚糖，主要由甘露糖和葡聚糖組成，此外還含有極少量半乳糖、半乳糖醛酸、巖藻糖等[8]。有別于以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品的做法，筆者采用甘露糖和葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定蘆薈多糖分子量。
多糖的性質(zhì)、生物活性和藥理作用與其重均分子質(zhì)量（MW）的大小密切相關(guān)[9-10]，因此測(cè)定多糖重均相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)研究其性質(zhì)、檢測(cè)其制品品質(zhì)具有重要意義。當(dāng)前，蘆薈多糖分子質(zhì)量的檢測(cè)多采用高效液相色譜（HPLC）法或高效凝膠滲透色譜（HPGPC）法，聯(lián)合示差折光檢測(cè)器（RID）或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）使用。目前采用高效凝膠過(guò)濾色譜（HPGFC）法聯(lián)合電噴霧檢測(cè)器（CAD）檢測(cè)蘆薈多糖重均分子質(zhì)量的研究未見(jiàn)報(bào)道。RID檢測(cè)器存在溫控要求苛刻且靈敏度低的問(wèn)題，ELSD檢測(cè)器存在基線漂移明顯、重現(xiàn)性較差的局限性，而CAD檢測(cè)器作為一種新型的通用檢測(cè)器，特別適用于糖類(lèi)的檢測(cè)，已被廣泛應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域[11]。筆者對(duì)庫(kù)拉索蘆薈凝膠凍干粉進(jìn)行多糖純化，建立HPGFC-CAD法測(cè)定蘆薈多糖重均分子質(zhì)量的分析方法，為后續(xù)蘆薈多糖的開(kāi)發(fā)研究和利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：Waters 2695型，美國(guó)沃特世公司。
CAD檢測(cè)器：Corona Veo型，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。
電子分析天平：AB135-S型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司。
臺(tái)式冷凍離心機(jī)：5417R型，德國(guó)艾本德公司。
超聲儀：KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司。
全系列T型葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：Dextran T5、T12、T25、T80、T410，平均分子質(zhì)量分別約為5 000、12 000、25 000、80 000、410 000 Da，CAS號(hào)為9004-54-0，美國(guó)西格瑪公司。
D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品：平均分子質(zhì)量為180.16 Da，編號(hào)為140651，中國(guó)食品藥品檢定研究院。
無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇：均為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
氯仿：色譜純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。
庫(kù)拉索蘆薈凝膠凍干粉：批號(hào)為20230704，云南萬(wàn)綠生物股份有限公司。
實(shí)驗(yàn)用水為高純水。
1.2 色譜條件
色譜柱：PolySep-GFC-P 4000柱（30 m×7.8 mm，5 μm，美國(guó)飛諾美公司）；檢測(cè)器：CAD檢測(cè)器；采集頻率：10 HZ；氮?dú)鈮毫Γ?241.3 kPa；過(guò)濾狀態(tài)：None；檢測(cè)溫度：25 ℃；流動(dòng)相：10 mmol/L乙酸銨溶液；流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：30 μL；洗脫方式：等度洗脫。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制
精密稱(chēng)取4.0 mg的全系列T型葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品及D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于2 mL容量瓶中，加入超純水溶解并定容至標(biāo)線，搖勻，制得各化合物的質(zhì)量濃度均為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃保存。
1.4 樣品溶液的制備
稱(chēng)取10 g庫(kù)拉索蘆薈凝膠凍干粉，加入20 mL高純水超聲溶解，加入無(wú)水乙醇至其體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，4 ℃冷藏過(guò)夜（12 h），4 000 r/min離心30 min，得沉淀，加適量高純水超聲溶解，加入0.5倍量Sevage試劑（氯仿與正丁醇體積比為 4:1）除去蛋白，濾液加入無(wú)水乙醇至其體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，于4 ℃冷藏不少于12 h，以4 000 r/min離心30 min，得多糖沉淀，用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次各洗滌2次，真空干燥得精制蘆薈多糖。精密稱(chēng)取該多糖20 mg，置于10 mL容量瓶中，加超純水約5 mL，超聲處理10 min，然后用超純水定容至標(biāo)線，配制得2 mg/mL的樣品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。
1.5 樣品測(cè)定
移取庫(kù)拉索蘆薈樣品溶液、D-甘露糖及全系列T型葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰保留時(shí)間，以色譜峰保留時(shí)間（tR）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的分子量對(duì)數(shù)值（lgMW）為縱坐標(biāo)，建立D-甘露糖和葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中多糖的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1 蘆薈多糖的提取
以往柱純化法分離多糖組分的方法耗時(shí)費(fèi)力且得率低，近年來(lái)，有機(jī)試劑分級(jí)沉淀等更綠色環(huán)保的方法被廣泛使用，蘆薈多糖的提取方法主要有水溶醇沉法、超聲協(xié)助提取法、微波輔助提取法和酶解法等[12-13]，基于成本最低且操作簡(jiǎn)單考慮，將水溶醇沉法與超聲波結(jié)合作為蘆薈多糖提取的一般操作方法。蔣文明等[14]在提取蘆薈多糖的過(guò)程中采用Savage試劑成功去除了蛋白質(zhì)?？紤]到蛋白質(zhì)可能對(duì)檢測(cè)存在干擾，實(shí)驗(yàn)往粗蘆薈多糖溶液中加入0.5倍量Sevage試劑除去蛋白，濾液加入無(wú)水乙醇至其體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，于4 ℃冷藏12 h后離心去除蛋白質(zhì)。
在室溫條件下，分別稱(chēng)取10 g庫(kù)拉索蘆薈凝膠凍干粉，加入20 mL高純水，分別使用超聲處理2、4 h，均能充分溶解，色譜圖結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，處理2 h得到的色譜峰基線波動(dòng)明顯，故選擇水解時(shí)間為4 h。超純水和甲醇溶液均是多糖很好的溶劑，為了減少溶劑效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，同時(shí)考慮節(jié)約成本和環(huán)保，最終選取超純水作為溶劑,因此超聲波處理4 h水解蘆薈多糖，最終使用超純水作為溶劑的提取方法，得到的樣品溶液色譜峰峰形良好且信號(hào)穩(wěn)定。
圖1 不同超聲水解時(shí)間下庫(kù)拉索蘆薈多糖的分離色譜圖
2.2 色譜條件優(yōu)化
2.2.1 檢測(cè)器的選擇
CAD檢測(cè)器是一種新型通用檢測(cè)器，具有靈敏度高、重復(fù)性好、動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍寬、操作直觀簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，其檢測(cè)信號(hào)不依賴于被檢測(cè)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)不同結(jié)構(gòu)的化合物具有統(tǒng)一的響應(yīng)，已被應(yīng)用于糖類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)、固醇類(lèi)和皂苷類(lèi)等無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收樣品的檢測(cè)，與常用的ELSD檢測(cè)器、RID檢測(cè)器相比，其檢測(cè)限更低，不易受外界干擾，對(duì)低含量成分檢測(cè)的重復(fù)性更好[15-17]。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品以及蘆薈多糖樣品無(wú)紫外吸收，又沒(méi)有專(zhuān)屬性很好的顯色劑，因此采用CAD檢測(cè)器對(duì)蘆薈多糖重均分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示CAD檢測(cè)器精密度良好（RSD值小于2%），靈敏度高，可用于蘆薈多糖分子量的測(cè)定。
2.2.2 流動(dòng)相的選擇
流動(dòng)相中離子強(qiáng)度對(duì)多糖的保留時(shí)間有一定的影響，離子強(qiáng)度越大，多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線lg(MW)與tR線性回歸方程的相關(guān)性越好[18]。無(wú)揮發(fā)性鹽對(duì)CAD檢測(cè)器存在較大影響，且既往研究表明溶液中加入揮發(fā)性鹽乙酸銨可有效增加目標(biāo)化合物的響應(yīng)值并改善峰形[19]，因此分別采用2、5、10、15 mmol/L的乙酸銨溶液以及高純水洗脫系統(tǒng)對(duì)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高純水作為流動(dòng)相的出峰時(shí)間顯著提前且峰形不對(duì)稱(chēng)；隨著乙酸銨溶液的濃度從2 mmol/L增大到10 mmol/L，基線波動(dòng)減少、色譜峰拖尾現(xiàn)象減少，再增加其濃度對(duì)目標(biāo)化合物的峰形、響應(yīng)影響不明顯，但會(huì)顯著增大色譜柱壓力。
適當(dāng)濃度的乙酸銨溶液能夠提供足夠的離子強(qiáng)度屏蔽靜電力，使多糖呈自然卷曲狀態(tài)，準(zhǔn)確反應(yīng)真實(shí)分子尺寸。當(dāng)乙酸銨濃度過(guò)低（小于5 mmol/L），流動(dòng)相離子強(qiáng)度不足，導(dǎo)致多糖分子與固定相之間發(fā)生非特異性吸附；當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)流動(dòng)相黏度顯著上升，柱壓升高，出現(xiàn)堵塞情況且加速固定相損壞，與曾航日等[20]報(bào)道一致。綜合考慮，最終選擇10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。
2.2.3 色譜柱、流量的選擇
采用的溶劑為高純水，故而選用PolySep-GFC-P4000色譜柱，因其內(nèi)含高親水性合成聚合物固定相，適用于水溶性聚合物，與分離基質(zhì)發(fā)生非特異性相互作用的概率低。根據(jù)色譜柱越長(zhǎng)，分離度越好，選用30 m長(zhǎng)，內(nèi)徑為7.8 mm的色譜柱。鄭曉倩等[21]評(píng)估不同流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）的分離效果發(fā)現(xiàn)，流量變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小；但當(dāng)流量為1.0 mL/min時(shí)，各色譜峰的分離度良好、峰寬較小，因此考察流量分別為1.0、1.2 mL/min條件下對(duì)色譜峰分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1.2 mL/min流量條件下的出峰時(shí)間過(guò)早，色譜峰不對(duì)稱(chēng)且有干擾峰，最終確定流量為1.0 mL/min，可使柱壓保持在合理范圍。
2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)
2.3.1 專(zhuān)屬性
按照1.2色譜條件測(cè)定D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品、5種不同分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和蘆薈多糖樣品溶液，疊加色譜圖結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品出峰位置無(wú)干擾峰，分離效果及峰形均較好，表明該方法專(zhuān)屬性良好。
圖2 分離色譜圖
2.3.2 線性關(guān)系
在1.2色譜條件下，分別對(duì)D-甘露糖及Dextran T5、T12、T25、T80、T410標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，色譜峰保留時(shí)間分別為10.607、9.259、8.869、8.276、7.673、7.046 min。以色譜峰保留時(shí)間(tR)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值(lgMW)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)，得到回歸方程為lgMW = 11.974-0.906tR，線性相關(guān)系數(shù)為0.990。式中MW的線性范圍為180~410 000 Da，線性關(guān)系良好。
表1 全系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定結(jié)果
2.3.3 精密度試驗(yàn)
按照1.3標(biāo)準(zhǔn)品處理方法制備6份平行Dextran T5葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.2色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣，記錄色譜峰保留時(shí)間，精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，Dextran T5葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品平均色譜峰保留時(shí)間為9.335 min，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%，說(shuō)明該方法的精密度良好。
表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果
2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)
按照1.4樣品溶液的制備方法制備樣品，取同一樣品溶液，使用1.2色譜條件，分別在第0、1、2、4、8 h時(shí)進(jìn)樣，記錄色譜峰保留時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.7%和2.0%，表明樣品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)
精密稱(chēng)取同一樣品，共5份，按照1.4樣品溶液制備方法制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，按照1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.8%（n=5）和1.4%（n=5），表明該方法的結(jié)果重復(fù)性良好。
表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
2.3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)
按照1.3標(biāo)準(zhǔn)品處理方法制備Dextran T5葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.2色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰保留時(shí)間，代入2.2.2線性回歸方程，計(jì)算得其重均分子質(zhì)量，計(jì)算測(cè)定值和理論值的相對(duì)誤差，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差為1.58%（n=6），說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。
表5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果
3 結(jié)語(yǔ)
建立了高效凝膠過(guò)濾色譜-電噴霧式檢測(cè)器法測(cè)定蘆薈多糖重均分子質(zhì)量的分析方法，該方法樣本多糖提取處理操作簡(jiǎn)單，成本低，精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較好。該方法為蘆薈多糖及其他多糖重均分子質(zhì)量的測(cè)定提供了檢測(cè)手段，為進(jìn)一步研究其生物活性利用奠定了基礎(chǔ)，并為其應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
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