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引子：

本文是Tony Cundell博士在American Pharmaceutical Review雜志文章“Is Bacillus subtilis Objectionable in a Non-Sterile Oral Liquid Solution?”的全文翻譯。聽過不少不可接受微生物評估的講座，也寫過一些個人意見的文章，但是一直覺得缺少實戰(zhàn)的演練。這篇文章正好就是給你打了個樣，你完全可以遵循作者的思路和框架，更換你自己的產(chǎn)品信息和配套資料，完成不可接受微生物的評估。文章很長，但是值得收藏分享給更多需要的人。

簡介

美國聯(lián)邦藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）法規(guī)，即《聯(lián)邦法規(guī)匯編》第21篇第211.113節(jié)（微生物污染控制），要求藥品生產(chǎn)商在其非無菌藥品中排除不可接受的微生物。哪些微生物可能被視為不可接受，可以從臨床文獻、與藥品和醫(yī)療器械相關(guān)的微生物感染爆發(fā)調(diào)查以及（程度較輕的）美國藥品召回信息中確定。在缺乏監(jiān)管指南的情況下，這一問題曾是2014年P(guān)DA技術(shù)報告第67號《在非無菌藥品、非處方藥品、醫(yī)療器械和化妝品中排除不可接受微生物》的主題。該PDA技術(shù)報告得出結(jié)論認為，哪些屬于不可接受微生物將取決于藥品劑型、配方、單個藥品的物理化學(xué)及微生物屬性及其預(yù)期用途。作者在最近的一篇書籍章節(jié)中更新了這些內(nèi)容（Cundell, 2020）。

根據(jù)Sutton和Jimenez（2012年）發(fā)布的美國非無菌產(chǎn)品召回調(diào)查，每年約有15-20起召回。也許令一些人驚訝的是，召回的主要原因是這些產(chǎn)品中存在不可接受的微生物（占72%），而不是超過了推薦的微生物限度。

在2004-2011年的7年期間，共有144種非無菌藥品被自愿召回。按產(chǎn)品類型劃分，召回情況為：非處方藥品（42%）、化妝品和肥皂（31%）、醫(yī)療器械（14%）、膳食補充劑和益生菌（8%）以及藥品（5%）。由于處方藥嚴格遵守現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（cGMPs）且擁有更多的財力與技術(shù)資源，其召回數(shù)量在這些產(chǎn)品類型中最少可能并不出人意料。在這144起召回中，涉及的不同微生物及其頻率為：洋蔥伯克霍爾德菌（34起召回，占所有召回的24%）、未具體說明的真菌（19起召回，占13%）、蠟樣芽孢桿菌（9起召回，占6%）、銅綠假單胞菌（6起召回，占4%）、腦膜膿毒性伊麗莎白菌（5起召回，占4%）、惡臭假單胞菌（3起召回，占2%）、假單胞菌屬（2起召回，占2%）和沙門氏菌屬（1起召回，占1%）。

蠟樣芽孢桿菌在輕微、自限性腸道功能紊亂中的作用可能是該細菌被召回的一個原因。根據(jù)FDA的《有害微生物手冊》，食品中大量存在蠟樣芽孢桿菌（大于10^6cfu/克）表明該生物體活躍生長和增殖，這與由于產(chǎn)生細菌腸毒素而存在潛在健康危害是一致的。這些數(shù)量遠遠超過了口服液建議的“需氧菌總數(shù)不超過100 cfu/克”的限度。

作者之所以關(guān)注此問題，是因為2019年12月18日，制造商Lannett公司（位于賓夕法尼亞州費城）因微生物污染在全國范圍內(nèi)自愿召回了抗癲癇藥左乙拉西坦口服溶液（100 mg/mL）。FDA網(wǎng)站（www.fda.gov/recalls）上發(fā)布的召回通知稱，該產(chǎn)品受到污染是因為在用于生產(chǎn)該產(chǎn)品的一種藥用原料中發(fā)現(xiàn)了革蘭氏陽性芽孢桿菌——枯草芽孢桿菌。

本文將探討，如果在這種口服溶液中發(fā)現(xiàn)這種常見環(huán)境細菌的數(shù)量少于100 cfu/mL，是否應(yīng)被視為不可接受微生物。作者認為，制造商采取的立場值得商榷，并且在進行了全面的微生物污染風(fēng)險評估后，不太可能采取這種立場。

與產(chǎn)品召回相關(guān)的風(fēng)險聲明稱：“枯草芽孢桿菌在環(huán)境中普遍存在，盡管其致病潛力被描述為較低，但已有嚴重全身性感染的報道。健康危害的可能性取決于微生物污染的程度、劑量和治療持續(xù)時間以及患者的基礎(chǔ)狀況。免疫功能低下的患者有可能發(fā)生嚴重感染。迄今為止，Lannett公司尚未收到任何與此次召回相關(guān)的不良事件報告。”

作者認為，產(chǎn)品的配方、給藥途徑和劑量（即每日兩次使用滴管或量杯口服給藥）與全身性感染無關(guān)，且目標(biāo)患者群體（即癲癇患者）不太可能是免疫功能低下者，這些都降低了風(fēng)險。

產(chǎn)品配方

根據(jù)藥品說明書，左乙拉西坦口服溶液（100 mg/mL）是一種清澈、無色、葡萄味的液體，裝在473毫升（16液量盎司）的HDPE瓶中。每毫升含有100毫克左乙拉西坦。非活性成分包括：乙?；前匪徕?、檸檬酸、香精、甘油、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、純化水、檸檬酸鈉和山梨糖醇溶液。各成分的功能和微生物學(xué)屬性總結(jié)于表1。

表1：藥用成分、其功能和微生物學(xué)屬性

MIC = 最低抑菌濃度

影響枯草芽孢桿菌芽孢在產(chǎn)品中利用成分萌發(fā)和生長的關(guān)鍵物理化學(xué)和微生物學(xué)參數(shù)包括口服液的pH值、水分活度以及防腐體系對枯草芽孢桿菌的效力。盡管該細菌可以代謝山梨糖醇，但低pH值（4-5）和降低的水分活度（0.7-0.8）將阻止細菌生長，而對羥基苯甲酸甲酯/對羥基苯甲酸丙酯的防腐體系將對芽孢萌發(fā)后形成的任何營養(yǎng)體枯草芽孢桿菌具有活性（《藥用輔料手冊》）。

根據(jù)2001年NSF/ANSI關(guān)于非潛在危害食品的標(biāo)準，pH值小于或等于4.6且水分活度小于或等于0.85的食品不屬于潛在危害食品。請注意，相關(guān)細菌蠟樣芽孢桿菌生長的最低pH和aw要求分別為4.9和0.93。

更為相關(guān)的是，同一文件指出，對于含有芽孢但不含營養(yǎng)細胞的、無需進行時間/溫度控制的所謂“安全”食品，其最大aw值為0.92。國際知名的細菌芽孢專家Peter Setlow實驗室最近發(fā)表的一篇文章（Rao等，2017年）表明，將aw降至≤0.90的保濕劑可通過抑制芽孢皮層肽聚糖水解和/或吡啶二羧酸釋放的活化，阻止枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)。水分活度將通過兩種機制發(fā)揮微生物控制作用，即防止芽孢萌發(fā)和抑制萌發(fā)后芽孢的生長。

此外，枯草芽孢桿菌在pH低于4.9的口服溶液中不會生長，如果pH較高且發(fā)生生長，其營養(yǎng)細胞將被對羥基苯甲酸酯類防腐體系殺滅?；?span link-id="link-1778075722908-0.6176971595531726">柵欄技術(shù)的概念，該產(chǎn)品將不支持微生物生長，且營養(yǎng)體微生物無法在產(chǎn)品中存活（Leistner, 1994）。

攝入的枯草芽孢桿菌芽孢會發(fā)生什么變化？芽孢桿菌屬是腸道微生物群中的一個次要組成部分，其數(shù)量略高于從攝入植物材料中預(yù)期的水平。芽孢能在胃的酸性胃液和上腸道的膽汁鹽中存活，可能在腸道內(nèi)萌發(fā)，并以營養(yǎng)細胞或芽孢形式隨糞便排出?？莶菅挎邨U菌作為一種嚴格需氧菌，預(yù)計在下腸道的缺氧條件下生長不良（Hong等，2005年）。

盡管FDA的警告信沒有透露含有枯草芽孢桿菌的藥用成分的身份，但作者推測其為山梨糖醇溶液（70%，USP）。目前的USP專論沒有微生物學(xué)要求，但其配套的山梨糖醇粉末專論則有。

后者的規(guī)定是，使用平板法的需氧菌總數(shù)不超過1000 cfu/克，霉菌和酵母菌總數(shù)不超過100 cfu/克。作者在早前的一篇出版物中已討論過藥用輔料的微生物學(xué)屬性（Cundell, 2005年）。

根據(jù)《藥用輔料手冊》，山梨糖醇最有可能通過鎳催化劑高壓氫化高果糖玉米糖漿來制造。70%山梨糖醇的水分活度約為0.8，因此不支持芽孢萌發(fā)和細菌生長，但在合成后進入產(chǎn)品的細菌內(nèi)生芽孢可能在此物料中持續(xù)存在，并被帶入口服溶液。

考慮到70%山梨糖醇在工業(yè)上的廣泛使用，僅因其含有枯草芽孢桿菌這種普遍存在的環(huán)境細菌的芽孢而禁止制藥行業(yè)使用該原料是不合理的。

芽孢桿菌屬的哪些成員在非無菌藥品中屬于不可接受微生物？

顯然，更具侵襲性的主要細菌病原體——炭疽芽孢桿菌在任何非無菌藥品中都屬于不可接受微生物，但在GMP條件下生產(chǎn)的藥品中含有該細菌的可能性極低。盡管是腸毒素而非細菌本身引起腸道功能紊亂，但根據(jù)非無菌藥品的劑型、配方和預(yù)期用途，有理由將蠟樣芽孢桿菌指定為不可接受微生物。表2提供了六種常見芽孢桿菌的一些特征。

表2：區(qū)分六種常見芽孢桿菌的特征（根據(jù)《ASM臨床微生物學(xué)手冊》第10版）

E=橢圓形，S=球形，C=圓柱形，T=終端，V=可變

發(fā)酵食品和膳食補充劑中的枯草芽孢桿菌

從對發(fā)酵食品和益生菌的回顧中，攝入枯草芽孢桿菌芽孢的安全性變得更加明顯。能合成多聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢桿菌菌株被用作納豆（一種在日本飲食中很受歡迎的發(fā)酵大豆食品）生產(chǎn)的發(fā)酵劑（Kubo等，2011年）。據(jù)報道，納豆中的芽孢計數(shù)超過10^8 cfu/克。在東歐、亞洲和南美洲，市場上銷售著含有數(shù)十億枯草芽孢桿菌芽孢的益生菌產(chǎn)品（Hong等，2005年）。綜合評估已證明這些益生菌產(chǎn)品在毒性和致病力方面的安全性（Sanders等，2003年；Hong等，2008年；Jezewska-Frackowiak等，2018年）。

盡管FDA尚未批準益生菌菌株作為公認安全（GRAS）物質(zhì)的一項政策，但食品安全與應(yīng)用營養(yǎng)中心并未反對益生菌制造商提交材料中的安全性證據(jù)。

結(jié)論

作者觀察到，一些制藥商在收到FDA 483表的不良觀察結(jié)果時，為了展現(xiàn)應(yīng)有的謹慎勤勉，作為避免后續(xù)警告信的策略一部分，會采取召回含有不可接受微生物產(chǎn)品批次的便捷做法。這通常是在未就非無菌藥品中發(fā)現(xiàn)的微生物是否真正不可接受進行全面風(fēng)險評估的情況下進行的。

在缺乏全部細節(jié)的情況下，本文提出的證據(jù)表明，如果枯草芽孢桿菌在制造過程中存活，并且在產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量少于100 cfu/mL，則不應(yīng)被視為不可接受微生物。降低的水分活度、低pH值和強大的防腐體系將阻止芽孢形成細菌在口服溶液中生長?？莶菅挎邨U菌不被認為是明顯的病原體，并且作為嚴格需氧菌不會在人類腸道中增殖。這些因素降低了對所有患者群體造成細菌感染的風(fēng)險。

此外，因為在藥用原料中發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌芽孢而召回非無菌藥品，這種做法過于保守，特別是考慮到其中許多原料是工業(yè)商品。需要一種更細致的方法。

參考文獻

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