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藥品中N-亞硝胺（NAs）雜質(zhì)相關(guān)的潛在健康風險已引發(fā)顯著關(guān)注。監(jiān)管指南建議通過制定可接受攝入量限值（AIs）的方法來保護終生每日暴露的安全性。然而，對于使用時間短于終生（LTL）的藥品中NA雜質(zhì)是否適用相同限值仍存疑問。ICH M7(R2)指南針對致突變雜質(zhì)，通過為LTL暴露設(shè)定更高AIs來解決該問題；但當前針對歸屬"關(guān)注隊列"（潛在高效致癌物）的NA雜質(zhì)監(jiān)管指南尚未采納此方法。本研究填補了關(guān)鍵知識空白：NA的致癌效力取決于總暴露量而非劑量速率——這正是ICH M7(R2)中LTL處理方案的核心原則。

通過評估八種NAs及黃曲霉毒素B1（另一種高效致癌物）在21至120周暴露周期內(nèi)的嚙齒動物致癌性生物測定數(shù)據(jù)，所有案例研究均表明致癌效力由累積總劑量決定，與日劑量無關(guān)。這與ICH M7(R2)指南主張"LTL周期可適用更高AI限值"的立場一致。

 

1. 介紹

過去六年中，制藥污染物中發(fā)現(xiàn)的N-亞硝胺（以下簡稱NAs）引發(fā)的潛在健康問題受到高度關(guān)注，其中新型NAs（常與原料藥本身相關(guān)）缺乏傳統(tǒng)嚙齒動物致癌性數(shù)據(jù)。2020年首次發(fā)布關(guān)于評估藥品中NA雜質(zhì)的監(jiān)管建議，并隨科學進展多次更新。當化合物特異性數(shù)據(jù)不足時，可采用致癌效能分級法（CPCA）設(shè)定可接受攝入限值（AI）。

CPCA依據(jù)化學結(jié)構(gòu)考量（Kruhlak等，2024）將AI限值分為五級（18/26.5至1500納克/天），預(yù)計將隨科學發(fā)展持續(xù)完善（如Ponting等，2025）。懸而未決的問題是：針對終生每日使用藥品設(shè)定的NA雜質(zhì)AI限值，是否適用于短期或間歇用藥情形？

ICH M7(R2)指南（ICH, 2023；見第1.3節(jié)）通過建立暴露時間縮短則AI限值遞增的機制，為誘變性雜質(zhì)提供了通用解決方案。但該指南對NAs的適用性存疑，部分因其被歸為"關(guān)注類別"（CoC）——基于其可能具有強致癌性（見第1.4節(jié)）。

為此，健康與環(huán)境科學研究所（HESI）在其亞硝胺研究計劃（https://hesiglobal.org/gttc-nitrosamines/）框架下啟動研究項目，通過系統(tǒng)評估已發(fā)表的NA嚙齒動物致癌性文獻（重點關(guān)注暴露時長影響），探究ICH M7指南中短期暴露（LTL）原則對NAs的適用性。

本文雖會區(qū)分短期暴露與間歇暴露，但"LTL"將沿用ICH M7指南定義（ICH, 2023）統(tǒng)指兩種情形。本文呈現(xiàn)該研究成果，并通過回顧定量癌癥風險評估起源及ICH M7建立誘變性雜質(zhì)LTL暴露限值的科學基礎(chǔ)，為研究奠定理論框架。

1.1 癌癥風險評估：歷史與起源  

1969年，首個采用美國國家癌癥研究所標準化方案的嚙齒類生物測定研究報告發(fā)表；1976年《嚙齒類生物測定指南》隨之問世（Innes等, 1969; NCI, 1976），由此開啟了未來數(shù)十年化學致癌物定量評估方法的發(fā)展與演進。自那時起直至今日，定量癌癥風險評估傳統(tǒng)上（且最普遍地）基于慢性嚙齒類生物測定的劑量效應(yīng)數(shù)據(jù)。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和環(huán)境保護署（EPA）作為首批監(jiān)管機構(gòu)，于1970年代發(fā)布了致癌物定量健康風險評估指南（詳見Albert, 1994; Rodricks, 2019）。兩大機構(gòu)最初指南要求：通過多種統(tǒng)計方法對高劑量嚙齒類生物測定數(shù)據(jù)進行低劑量外推，從而確立被認為對人類構(gòu)成可忽略風險的暴露限值——該限值理論上代表經(jīng)食物或環(huán)境介質(zhì)每日終生暴露所導致的、超出本底水平的百萬分之一超額風險。

隨著時間的推移，嚙齒類生物測定方案的標準規(guī)范不斷調(diào)整，監(jiān)管指南也隨之演進（并發(fā)布了新版本），以提供更精細的優(yōu)化建議（Bucher, 2002; 美國FDA, 2006; ICH, 2022; NCI, 1976; OECD, 1981, 2018; Weisburger, 1983）。這些指南普遍認同：對于作用機制存在閾值的致癌物與默認無閾值的致癌物需采取不同的評估方法。后者包括已知或推定具有致突變作用機制的致突變性（DNA反應(yīng)性）致癌物。對此類化合物，通過嚙齒類生物測定的腫瘤劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)確立基準點，并以此為起點畫一條直線，作為建立人類健康風險值的依據(jù)。

針對藥物中的致突變性雜質(zhì)，ICH M7指南（ICH, 2023）明確規(guī)定：采用嚙齒類TD50值（終生每日暴露下導致腫瘤發(fā)生率較背景值增加50%的劑量率）作為基準點，由此確立以μg/天為單位的AI值，對應(yīng)理論致癌風險為十萬分之一。對于缺乏足夠數(shù)據(jù)推導化合物特異性AI值的致突變性雜質(zhì)，則采用基于毒理學關(guān)注閾值（TTC）的每日1.5 μg限量標準。

盡管嚙齒動物癌癥生物測定法和現(xiàn)行監(jiān)管指南在過去五十年間不斷發(fā)展，但某些重要歷史視角仍對當今人類健康防護具有現(xiàn)實意義——尤其針對不符合嚙齒動物生物測定中終身日常暴露模式的致癌物接觸（即短期暴露）。早在美國國家癌癥研究所首次開展生物測定之前的數(shù)十年研究中，科學家們致力于解析決定化學物質(zhì)致癌能力的關(guān)鍵因素，以及不同暴露條件如何影響致癌效力，這些重要發(fā)現(xiàn)同樣具有深遠價值。

2. 終生累積劑量（LCD）：癌癥風險評估的劑量指標  

癌癥風險評估傳統(tǒng)上基于一個前提：致癌效力取決于終生接收的總劑量。這一假設(shè)最初的經(jīng)驗基礎(chǔ)來自嚙齒動物研究中給藥方案與結(jié)果關(guān)聯(lián)性的探索。該領(lǐng)域最早的文獻之一——Druckrey與Kupfmuller（1948年）在奶油黃（3′-甲基-4-二甲氨基偶氮苯）研究中總結(jié)出以下核心發(fā)現(xiàn)：  

• "無論給藥周期分布在34天至1年間的哪個時段，誘發(fā)腫瘤需要達到特定的奶油黃總劑量。在此范圍內(nèi)，潛伏時間與日劑量水平呈反比關(guān)系。"  

• "誘導癌癥所需的奶油黃總劑量可視為現(xiàn)有癌癥易感性強度的衡量標準。"  

Druckrey和Kupfmuller（1948）同樣認識到這一普遍原理適用于他們提出的"Ct毒素"概念，其中"C"代表毒素的恒定濃度，"t"代表暴露時間。當時該規(guī)律僅在短期暴露（數(shù)小時至數(shù)天）中得到驗證，但Druckrey和Kupfmuller（1948）推測該關(guān)系同樣適用于由不可逆變化（包括突變）引發(fā)的效應(yīng)，即存在"效應(yīng)累積"現(xiàn)象。作者進一步類比X射線誘發(fā)的突變，指出突變總數(shù)由輻射總劑量決定。

二十年后，Druckrey（1967）基于上萬只大鼠實驗數(shù)據(jù)，系統(tǒng)總結(jié)了暴露量與致癌結(jié)果的關(guān)系。其團隊開展的對照研究專門聚焦致癌作用的"時間因子"，明確證實腫瘤發(fā)生取決于動物累積接收的劑量，而非日劑量。該原理雖常被稱為終生累積劑量（LCD），實則具有更廣泛的適用性，亦涵蓋短期研究中動物接收的累積劑量。

這一理論在4-二甲基氨基偶氮苯的突破性研究中得到驗證：維持大鼠日給藥劑量恒定為5毫克/天，暴露周期從40天至200天不等（采用"終止暴露"實驗設(shè)計，動物在停止給藥后仍持續(xù)觀察至研究期滿），LCD相應(yīng)為200至1000毫克/只。肝癌發(fā)生率隨暴露大鼠比例從20%升至81%，與LCD呈近似線性增長?；诖思岸囗椦芯?，Druckrey（1967）得出結(jié)論："致癌作用應(yīng)視為所有連續(xù)給藥總劑量的函數(shù)"。

特別是在亞硝胺研究中，早期嚙齒動物致癌性文獻除日攝入劑量外，普遍提及"單只動物累計劑量"并不令人意外。事實上，Druckrey（1967）在關(guān)于N-亞硝基二乙胺（NDEA）的實驗室研究中也采用了這種表述方式。Lijinsky等人（1988）發(fā)表的亞硝胺致癌性數(shù)據(jù)匯總表顯示，其僅采用"單只動物累計劑量（單位：毫摩爾）"作為有效劑量評估指標。

1.3 癌癥風險評估中的亞終生暴露考量

美國環(huán)保署在1986年頒布癌癥風險評估指南時，已有充分證據(jù)表明嚙齒類動物的腫瘤發(fā)生率與終生總給藥劑量相關(guān)（US EPA, 1986）。重要的是，支撐該結(jié)論的實證數(shù)據(jù)與致突變作用模式致癌物的特性一致——已知突變會在整個生命周期中累積；該結(jié)論也與公認的年齡與多數(shù)癌癥的關(guān)聯(lián)性相符（如Harrison與Doe，2021）。由于環(huán)保署常需評估那些未體現(xiàn)終生每日暴露的人類暴露場景（不同于1960年代末標準化規(guī)程中的嚙齒動物生物測試方案），1986年指南對此挑戰(zhàn)作出明確說明：

"當關(guān)注的人類暴露情境（如暴露途徑和給藥方案）與相關(guān)動物實驗存在顯著差異時，會產(chǎn)生特殊問題。除非個案存在反證，否則建議采用終生累積劑量（以終生按日平均計算的暴露量表示）作為致癌物暴露的適宜度量。即假設(shè)短期內(nèi)接受高劑量致癌物與終生接受相應(yīng)低劑量暴露具有等效性"（US EPA, 1986）。

因此，LCD（終生致癌劑量）和LADD（終生平均日劑量）的概念已成為癌癥風險評估的標準實踐，并被ICH M7指南所認可。該指南指出："對已知致癌物的標準風險評估假設(shè)癌癥風險隨累積劑量增加而升高。因此，終生連續(xù)低劑量暴露的癌癥風險應(yīng)當?shù)韧谳^短時間內(nèi)的相同累積暴露所產(chǎn)生的風險。"由于1970年代后開展的大多數(shù)嚙齒動物試驗均采用終生每日暴露模式，LADD常與試驗劑量重合，故LCD與LADD概念未被廣泛討論。但在評估非終生每日暴露的嚙齒動物致癌試驗，或評估人類短期/間斷暴露（LTL暴露）時，這些概念至關(guān)重要。

嚙齒動物致癌試驗的標準方案通常要求每日暴露持續(xù)24個月（默認壽命周期），其得出的風險值旨在為類似暴露模式的人群提供保護，并成為制定空氣/食品/飲用水雜質(zhì)限值等慢性暴露監(jiān)管的重要依據(jù)。然而許多人類暴露場景并非終生連續(xù)暴露，例如空氣/食品/水的短期污染事件，或符合嚴格雜質(zhì)限值的消費品短期/間斷使用場景。部分監(jiān)管指南（美國環(huán)保局2005；毒物與疾病登記署；加州環(huán)保局2001）建議通過LADD折算人類暴露量，再與慢性動物試驗確立的癌癥風險值比對。相比之下，對藥物中的致突變雜質(zhì)則采取修正癌癥風險值（即AI，允許攝入量）的策略，允許短期更高暴露（見1.4節(jié)）。

關(guān)鍵的是，雖然LCD和LADD作為癌癥風險評估的重要劑量指標已被廣泛接受，但在癌癥風險評估中如何應(yīng)用這些指標仍存在疑問，尤其當暴露持續(xù)時間縮短時。這一點在美國環(huán)境保護署（EPA）1986年發(fā)布的注意事項中得到突顯，該機構(gòu)認識到若將LCD壓縮至過短時限會產(chǎn)生重大局限："當相關(guān)暴露強度增加但頻率降低時，特別是當有證據(jù)表明該物質(zhì)存在劑量率效應(yīng)時，此方法會變得更成問題"（US EPA, 1986）。

盡管當時已認識到這是應(yīng)用LTL的局限性，但尚未提出推薦解決方案。這一局限，加上對LTL暴露考量方式缺乏統(tǒng)一標準，促使國際生命科學研究所（ILSI）和HESI聯(lián)合開展研究項目。2009年召開的研討會匯集了來自工業(yè)界、監(jiān)管機構(gòu)、學術(shù)界和非政府組織（NGO）的癌癥風險評估專家，最終形成出版物提出了包含決策樹和指導原則的LTL暴露癌癥風險評估框架（Felter等, 2011）。該框架成為ICH M7關(guān)于藥物致突變雜質(zhì)LTL癌癥風險指南的基礎(chǔ)（首次發(fā)布于2014年，并持續(xù)更新至2023版指南）。

1.4. 關(guān)于致突變雜質(zhì)有限治療期（LTL）的ICH M7指導原則  

許多藥物僅適用于短期治療，在患者生命周期內(nèi)不會長期使用，例如麻醉劑或抗生素。同樣，臨床試驗中的候選藥物通常僅限定期使用。其他藥品可能持續(xù)使用數(shù)十年但僅為間斷性需求（如感冒藥和其他非處方產(chǎn)品）。為考量LTL暴露，Müller等人（2006年）提出分階段TTC概念用于藥品致突變雜質(zhì)，該方案經(jīng)修訂后被納入2014年ICH M7指導原則。1.5微克/天的TTC被視為致突變雜質(zhì)的可接受攝入量（AI），基于致癌物效能的線性反向外推法，其終生暴露理論致癌風險不超過十萬分之一。ICH M7默認人類壽命為70年（25,550天），按TTC每日終生暴露累計劑量為38.3毫克（即1.5微克×25,550天）。  

ICH M7指導原則同時為建立LTL暴露的AI提供建議：由于暴露持續(xù)時間縮短可能導致效能濃度（LCD）增強，針對單個雜質(zhì)的推薦AI隨暴露期縮短采用漸進增大的安全系數(shù)（見表1）。該指導原則還涉及多致突變雜質(zhì)LTL暴露的處理方案。  

對于間歇給藥（如每周僅用藥一次），同樣適用LTL概念。此時應(yīng)根據(jù)總給藥天數(shù)計算暴露持續(xù)時間，對應(yīng)上述四種定義的暴露期類別及LTL-AI標準。當具備可靠致癌性數(shù)據(jù)時，應(yīng)采用化合物特異性風險評估替代TTC方法。默認方案是通過最相關(guān)致癌性研究的TD50值進行線性外推，此為確定已知致突變致癌物AI的首選方法。表1所述的LTL-AI限值比例可同樣用于化合物特異性AI，以調(diào)整較短治療周期。例如：對于≤1個月、≥1-12個月、≥1-10年的暴露期，LTL調(diào)整因子分別比慢性/終生AI高80倍（120/1.5微克/天）、13.3倍（20/1.5微克/天）和6.7倍（10/1.5微克/天）。

1.5. 嚙齒動物TD50：基于亞終身（LTL）嚙齒動物生物測定進行AI計算的調(diào)整  

致突變雜質(zhì)可接受攝入量（AIs）的制定基于從嚙齒動物TD50值線性外推至十萬分之一理論超額致癌風險。因此，理解TD50的計算方法至關(guān)重要——尤其當數(shù)據(jù)源自未涉及終身暴露和/或非標準研究周期的嚙齒動物生物測定時。TD50定義為"在標準實驗周期（該物種的'標準壽命'）結(jié)束時，使經(jīng)精算調(diào)整的無腫瘤動物比例減半的慢性劑量率（單位：mg/kg體重/天）"（Peto等, 1984）。對于涉及亞終身（LTL）給藥和/或研究周期長于或短于標準壽命（嚙齒類為104周）的生物測定，需進行定量調(diào)整：  

首先，調(diào)整給藥劑量以反映嚙齒動物在研究周期內(nèi)接受的平均日劑量，該劑量將用于劑量反應(yīng)模型推導TD50。若研究周期短于（或長于）標準壽命，則需二次調(diào)整TD50。因為已知終生致癌風險隨年齡增長而升高，對于早于或晚于標準兩年壽命終止的嚙齒動物致癌性生物測定，需特別考量其相比終身生物測定對腫瘤結(jié)果的預(yù)期影響。  

為修正研究周期的影響，Peto等（1984）建議TD50應(yīng)納入f²d的調(diào)整因子（其中f定義為實驗周期/標準壽命，d為劑量率）。例如一年期研究將使TD50降低4倍[（1年/2年）²=0.25]。需強調(diào)：此研究周期修正是TD50估算流程的既定環(huán)節(jié)，已常規(guī)應(yīng)用于致癌效力數(shù)據(jù)庫（CPDB）和Lhasa致癌性數(shù)據(jù)庫（LCDB）的TD50計算。  

如此，公布的TD50值均折算為預(yù)期導致半數(shù)動物因化學暴露患癌的終生每日暴露量，與其原始計算依據(jù)的實驗方案無關(guān)。該特性對于評估非終身每日暴露于人群的場景時，如何應(yīng)用嚙齒動物TD50推導的AIs具有重大意義。

1.6. 關(guān)于對亞硝胺采用AI限度時應(yīng)用LTL調(diào)整的考量  

亞硝胺是一類化學結(jié)構(gòu)中含有N-亞硝基（R?N-N=O）官能團的化合物。部分亞硝胺被列為已知人類致癌物，另一些則可能或很可能對人類具有致癌性（國際癌癥研究機構(gòu)，1978，2007）。現(xiàn)有大量嚙齒動物致癌性試驗數(shù)據(jù)庫，涵蓋多種實驗方案。與其他化學致癌物類似，其作用靶器官和效力受物種、給藥途徑等多種因素影響。最可靠的數(shù)據(jù)來自大鼠口服試驗，其中肝臟和上消化道是亞硝胺最常見的靶器官。  

亞硝胺的主要安全風險在于其屬于高效誘變致癌物類別（因含N-亞硝基亞結(jié)構(gòu)），在ICH M7(R2)指南中被稱為"關(guān)注隊列"（ICH，2023）。亞硝胺的致癌效力跨越數(shù)個數(shù)量級，部分在嚙齒動物中表現(xiàn)出強效致癌活性（Kroes等，2004；Snodin，2023；Thresher等，2020）。根據(jù)ICH M7建議，關(guān)注隊列化合物需單獨評估——即使攝入量低于1.5μg/天的TTC閾值，理論上仍存在顯著致癌風險，故應(yīng)采用個案分析法。  

"關(guān)注隊列"術(shù)語由Kroes等（2004）首次提出，指代現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明TTC限度不足以為其提供充分保護的幾類致癌物（包括黃曲霉毒素和疊氮化合物）。Cheeseman等（1999）早期分析包含101種N-亞硝基化合物，Kroes補充了4種（但該數(shù)據(jù)集無法重建，Snodin 2023）。其中58種（55%）的致癌效力超過TTC限度（即TD??＜1.5mg/kg/天）。在101種N-亞硝基化合物中，65種為亞硝胺，其中44種（68%）在嚙齒動物中的致癌效力超過ICH M7框架規(guī)定的TTC限度（1.5μg/天）。

根據(jù)ICH M7方法學分析的大量亞硝胺(NA)致癌性數(shù)據(jù)表明，其可接受攝入量(AI)限值低于毒理學關(guān)注閾值(TTC)。因此，達到TTC的暴露水平將導致理論終生致癌風險超過十萬分之一（該風險水平被普遍認可為藥品安全閾值）（ICH, 2023; Kroes等, 2004）。目前藥品監(jiān)管機構(gòu)（EMA, 2024; 美國FDA, 2021; 加拿大衛(wèi)生部, 2024）未對NA雜質(zhì)采用ICH M7指南中的長期低劑量(LTL)調(diào)整因子設(shè)定AI限值。

唯一例外是歐洲藥品管理局(EMA)允許對CPCA分類1-4級的NA采取臨時限值：通過運用ICH M7中最保守的兩項LTL調(diào)整因子，將AI限值提升至13.3倍（治療周期≤12個月）或6.7倍（治療周期＞12個月），但每日最大暴露量不超過1.5微克。該臨時限值適用于已上市產(chǎn)品，可在糾防措施(CAPA)實施期間（最長達三年）使用（EMA, 2024）。

盡管如此，LTL調(diào)整對額外致癌風險的影響仍存不確定性，原因包括：某些NA化合物具有強致癌性、短期暴露即可誘發(fā)腫瘤、暴露增加可能超出DNA修復(fù)能力及引發(fā)毒性反應(yīng)（伴隨再生性細胞增殖）、以及多重用藥的影響。本文旨在探討NA嚙齒類致癌性數(shù)據(jù)是否符合LTL框架基本原則（即致癌效力由最低致癌劑量決定，而非日劑量或劑量速率）。針對LTL方法適用性的其他質(zhì)疑，相關(guān)研究仍在持續(xù)進行中。

 

2. 方法  

2.1. 基于不同暴露周期的嚙齒類致癌性數(shù)據(jù)識別亞硝胺  

本研究雖聚焦于評估亞硝胺（NAs）的嚙齒類致癌性數(shù)據(jù)，但將檢索范圍擴展至Kroes等（2004）基于（潛在）高效性列入關(guān)注化合物（CoC）清單的其他物質(zhì)。通過Knime軟件（4.4.0版，www.knime.org）篩選Lhasa致癌性數(shù)據(jù)庫（LCDB）2024.1版數(shù)據(jù)，選定符合以下條件的CoC化合物：存在同一物種多種暴露周期記錄（排除含單次劑量實驗的研究），包括N-亞硝基化合物（SMARTS NN=O）、烷基-氧化偶氮化合物（SMARTS [#6][N+]([O-])=N[#6]），以及通過雙呋喃亞結(jié)構(gòu)識別的黃曲霉毒素衍生物（SMARTS C12C(O[C,c]~[C,c]1)O[C,c]~[C,c]2，圖1）。

 

最終獲得18種亞硝胺化合物（其余N-亞硝基化合物經(jīng)人工剔除）和1種黃曲霉毒素（表2）。需說明，本文撰寫期間LCDB于2024年7月更新，部分TD50值因暴露周期調(diào)整發(fā)生變動。經(jīng)核驗，本研究涉及化合物的數(shù)值變化未影響最終結(jié)論。

 

2.2. 納入標準  

對步驟1中識別出的具有不同給藥方式和/或研究時長的嚙齒動物致癌性數(shù)據(jù)的核苷酸類似物（NAs）進行致癌性研究審查，評估其是否適用于LTL（長期低劑量）分析。額外分析黃曲霉毒素B1，因其亦被視為CoC（致癌性關(guān)注）化合物（Kroes等，2004）。針對每種化合物評估LCDB（終身致癌性數(shù)據(jù)庫）中的致癌性數(shù)據(jù)，并比照LTL致癌性評估的納入標準。具體而言，判定化合物是否具備充分評估數(shù)據(jù)需滿足：通過相同暴露途徑，在相同物種、品系和性別的嚙齒動物中獲取不同研究時長的致癌性數(shù)據(jù)。最可靠的比較應(yīng)源于同一實驗室的研究，且理想情況下需針對相同（最敏感）靶器官的腫瘤進行比較。

我們認為任何口服暴露（飲食、飲水、灌胃）均可用于其他口服研究的對比，但優(yōu)先采用相同給藥方式，因灌胃與其他口服給藥可能產(chǎn)生毒代動力學差異。最后共識是：含單劑量組與對照組的試驗可個案評估，因其仍可能提供定量或定性層面的有效信息。  

各化合物由主評審員負責評估可用數(shù)據(jù)是否符合納入標準。主評審結(jié)論經(jīng)同行評審員或小型評審團隊復(fù)核后，提交全體團隊審議。最終形成關(guān)于該化合物數(shù)據(jù)可靠性分類的共識建議。共計九種化合物（八種NAs及黃曲霉毒素B1）的LCDB研究符合納入標準，其詳細分析見下文。另有三種NAs的數(shù)據(jù)部分滿足標準，可進行定性評估。其余七種NAs因數(shù)據(jù)不足無法支持LTL評估。

 

3.結(jié)果

在LCDB中總共鑒定出18種NAs具有涉及多次暴露和/或研究持續(xù)時間的致癌性數(shù)據(jù)。18種NAs中有8種及黃曲霉毒素B1（另一種CoC致癌物）在LCDB中擁有符合納入標準的數(shù)據(jù)。NA案例研究均通過飲用水途徑進行，而黃曲霉毒素B1則涉及飲食研究。我們注意到，在這些案例研究的出版物中，"劑量率"一詞通常用于指代整個暴露期間使用的飲用水濃度，如各案例所述。我們保留了"劑量率"這一術(shù)語，并沿用原始數(shù)據(jù)中報告的飲用水濃度值（而非以mg/kg bw/天表示的攝入量）。表2總結(jié)了這些案例研究的關(guān)鍵信息，后附各研究簡要概述。盡管這些研究均發(fā)表于1970-1980年代，與現(xiàn)行指導方案相比存在局限性，但其設(shè)計常專門用于探究效價與日劑量/累積劑量等變量的關(guān)系，因而特別適用于本次評估.

3.1.符合納入標準的案例研究結(jié)果  

3.1.1.N-亞硝基二乙胺  

一項關(guān)于NDEA的致癌性研究在同一品系和性別的動物中設(shè)置了不同暴露周期，符合納入標準。該研究(Lijinsky等,1981)中對雌性F344大鼠(20只/劑量組)通過飲用水每周給藥5天NDEA。暴露后動物上消化道(食道、前胃、舌和口咽)腫瘤發(fā)生率顯著上升。暴露周期包括：17、22、30、60和104周，計劃總研究周期為130周。給藥濃度隨暴露周期變化如下：  

1)17周暴露(113 mg/L)  

2)22周暴露(45 mg/L)  

3)30周暴露(0,0.45,1.1,2.8,7,18 mg/L)  

4)60周暴露(0,0.45,1.1 mg/L)  

5)104周暴露(0,0.45 mg/L)  

原研究者發(fā)現(xiàn)≥7 mg/L劑量組存在顯著早期死亡現(xiàn)象，故排除這些數(shù)據(jù)。研究者計算的終生累積劑量(LCD)與給藥濃度、暴露周期及患瘤動物數(shù)量如表3所示。剩余組數(shù)據(jù)顯示患瘤動物比例與LCD呈明顯正相關(guān)(表3)，而非與給藥濃度或周期直接關(guān)聯(lián)。0.45 mg/L濃度在30/60/104周三個周期進行測試，分別相當于假定104周壽命的29%、58%和100%。暴露周期從30周(壽命29%)延長至60周(壽命58%)時，腫瘤發(fā)生率增長3倍(10%→30%)；全程暴露(100%壽命)較30周暴露腫瘤增加7倍，較60周暴露增加2.3倍。該結(jié)果符合c×t²·³=k的經(jīng)典方程(Druckrey,1967;Peto等,1984)，表明時間(t)對腫瘤發(fā)展的影響大于濃度(c)。

 

3.1.2. 二亞硝基高哌嗪  

在LCDB數(shù)據(jù)庫中檢索到一項關(guān)于DNHP致癌性數(shù)據(jù)的研究。該研究在同一品系和性別的動物中設(shè)置了不同暴露時長，符合納入標準。該研究(Lijinsky等, 1982a)中，雌性F344大鼠(每組20只)通過飲水攝入DNHP。結(jié)果顯示實驗動物上消化道(食道、前胃、舌、口咽和會厭)腫瘤發(fā)生率顯著上升。暴露周期包括30周、60周和120周，總研究周期計劃為133周。劑量率隨暴露時長調(diào)整如下：1)30周暴露(0、1.1、2.8、7、18、44、110毫克/升)；2)60周暴露(0、7毫克/升)；3)120周暴露(0、1.1、2.8毫克/升)。原作者確定的LCD值及相應(yīng)劑量率、暴露時長和患瘤動物數(shù)量見表4。高劑量組動物死亡率顯著高于對照組，最終影響研究周期。由于高劑量組死亡率過高，研究者在分析中剔除了這些組別。

其余組別數(shù)據(jù)表明，患瘤大鼠數(shù)量與累積劑量(LCD)呈明顯正相關(guān)，而非取決于劑量率或暴露時長。如表4所示，相同劑量率(2.8毫克/升)暴露30周與120周相比，腫瘤發(fā)生率增長4-5倍。換而言之，1.1毫克/升劑量暴露120周組有25%大鼠發(fā)生腫瘤，而2.8毫克/升(劑量率提高2.5倍)僅暴露30周組腫瘤發(fā)生率僅為20%。

3.1.3 N-亞硝基-1,2,3,6-四氫吡啶  

在LCDB數(shù)據(jù)庫中鑒定到一項關(guān)于NTHP的致癌性研究(Lijinsky等, 1982a)。該研究符合納入標準：NTHP以三種不同暴露時長給予單一物種、品系和性別的動物，且原始文獻提供了充分數(shù)據(jù)以驗證靶器官的荷瘤動物數(shù)。  

雌性F344大鼠通過飲水給予NTHP(每周5天；約20mL/鼠/日)，分為25周組(1, 2.6, 16, 40, 100 mg/L)、70周組(6.4 mg/L)和100周組(1, 2.6 mg/L)。未處理對照組與NTHP給藥組均飼養(yǎng)至自然死亡，或在瀕死狀態(tài)/研究結(jié)束時(約130周)實施安樂死。雖然25周組中16 mg/L(生存期=116周)、40 mg/L(生存期=52周)、100 mg/L(生存期=25周)以及70周組6.4 mg/L(生存期=100周)出現(xiàn)全因死亡率升高，但所有劑量組均在處死時記錄腫瘤發(fā)生率。上消化道腫瘤(乳頭狀瘤和/或癌)是最常見類型，包括食道、前胃、口咽及會厭部位腫瘤，因此該部位被視作評估腫瘤發(fā)生率與累積劑量(LCD)、劑量率和/或暴露時長關(guān)系的關(guān)鍵靶點。  

如表5所示，本案例中腫瘤發(fā)生率與LCD未呈現(xiàn)嚴格相關(guān)性。但相同劑量率下延長暴露時長(對應(yīng)更高LCD)時，觀察到胃腸道腫瘤發(fā)生率升高(對比1.0 mg/L劑量率25周與100周、2.6 mg/L劑量率25周與100周、6.4 mg/L劑量率25周與70周數(shù)據(jù))。此外，在相似LCD下(45 mg與40 mg)，較低劑量率配合較長暴露時間(6.4 mg/L持續(xù)70周 vs 16 mg/L持續(xù)25周)并未降低上消化道腫瘤發(fā)生率(分別為20/20與15/20)。  

 

最后，較高劑量率(2.6 mg/L)短期暴露(25周)給予6.5 mg LCD時，相較于較低劑量率(1 mg/L)長期暴露(100周)給予10 mg LCD，未觀察到胃腸道腫瘤發(fā)生率升高(分別為1/20與10/20)。  

本案例中上消化道腫瘤發(fā)生率與總累積劑量無明確量效關(guān)系。但在相同劑量率(不同LCD)或相似LCD(不同劑量率)的給藥組間比較表明：雌性F344大鼠上消化道腫瘤發(fā)生率取決于LCD而非劑量率。該數(shù)據(jù)同時證實暴露時長比日劑量影響更大，此規(guī)律與NDEA研究結(jié)論一致(見3.1.1節(jié))。

3.1.4. N-亞硝基七亞甲基亞胺（N-HEP）

Lijinsky等人（1982b）報道了一項在F344大鼠中進行的N-HEP致癌性研究：20只雄性大鼠組分別通過飲用水攝入1-40 mg/L劑量的N-HEP，持續(xù)25、50或100周。另有雌雄動物接受高劑量（100 mg/L）N-HEP及氘代N-HEP試驗，但該部分因13周時出現(xiàn)顯著毒性而終止，故不納入本次總結(jié)。

N-HEP暴露組的上消化道（食管、前胃、舌及口咽部）腫瘤發(fā)生率升高。各暴露周期劑量如下：1）25周暴露期（0、6.40、16 mg/L）；2）50周暴露期（0、1、2.6、6.4 mg/L）；3）100周暴露期（0、1、2.6 mg/L）。終生累積劑量（LCD）、劑量率、暴露周期及患癌/乳頭狀瘤動物數(shù)量/比例見表6。

 

>40 mg/L的劑量率導致過度毒性，數(shù)據(jù)未納入表格。≥16 mg的LCD使試驗系統(tǒng)達到飽和（這些劑量組中≤75%動物出現(xiàn)上消化道癌變或乳頭狀瘤）。在0-16 mg LCD的N-HEP處理組中，作者觀察到總劑量與癌/乳頭狀瘤發(fā)生率存在"明顯線性關(guān)系"，但劑量率或暴露周期無此相關(guān)性。

3.1.5. N-亞硝基嗎啉  

一項關(guān)于NMOR（Lijinsky等，1988）在雌性Fischer 344大鼠中的致癌性研究符合納入標準。NMOR通過飲用水每周5天給予雌性Fischer 344大鼠。兩個最低劑量組各有100只動物，80只動物作為未處理對照組。六個中間劑量組每組96只大鼠，其中半數(shù)處理50周，半數(shù)處理100周。最高劑量組中，24只大鼠分別接受25、40或50周的NMOR處理。  

從最低劑量組開始，隨著NMOR的終身累積劑量（LCD）增加，肝臟腫瘤（包括肝細胞腺瘤、肝細胞癌或血管肉瘤）發(fā)生率呈現(xiàn)統(tǒng)計學顯著上升趨勢。良性肝臟腫瘤主要出現(xiàn)在低劑量組，而高劑量組中惡性腫瘤發(fā)生率增加。數(shù)據(jù)顯示肝腫瘤發(fā)生率與LCD呈明顯線性相關(guān)（表7匯總）；死亡中位時間與總劑量間也存在類似關(guān)聯(lián)。尤其在中劑量組中，劑量率與腫瘤發(fā)生率明顯缺乏關(guān)聯(lián)——例如，給予0.45 mg/L處理100周的動物（7/48只出現(xiàn)腫瘤）與給予1.1 mg/L處理50周的動物反應(yīng)相同，再次凸顯LCD的關(guān)鍵作用。

 

3.1.6. N-亞硝基甲基-(2-苯乙基)胺  

LCDB數(shù)據(jù)庫收錄了一項關(guān)于NMPEA致癌性的研究(Lijinsky等,1982c)。該研究因在同一品系同性大鼠中設(shè)置了不同暴露時長（含因受試物相關(guān)死亡導致的差異），符合納入標準。29只雄性F344大鼠（20只/劑量組）通過飲用水攝入NMPEA后，上消化道（食管、前胃、舌、口咽及鼻腔）腫瘤發(fā)生率顯著上升。所有劑量組設(shè)計暴露周期為33周，但最高兩個劑量組因嚴重毒性分別于30周和21周終止。增設(shè)的低劑量組暴露周期為104周。具體劑量安排：1)33周暴露組(0,0.4,1.1,3.2,9.5,28,115 mg/L)，其中28和115 mg/L組實際暴露21/30周；2)104周暴露組(0,0.4 mg/L)。停用后動物自然死亡：低劑量組存活至約127周，9.5/28 mg/L組約42周，115 mg/L組約21周。  

如表8所示，高劑量組動物死亡率顯著高于對照組（如最高劑量組半數(shù)動物2周內(nèi)死亡），直接影響研究周期。最高劑量組中存活動物停用2周后恢復(fù)給藥，研究者認為幸存動物"消除了損傷源從而存活至腫瘤發(fā)生"。由于最高劑量組大量死亡，劑量與帶瘤死亡時間未呈現(xiàn)線性關(guān)系。原研究者排除三個高劑量組及104周組后，其余組在相同暴露周期內(nèi)呈現(xiàn)腫瘤發(fā)生率與終生致癌劑量(LCD)的劑量反應(yīng)關(guān)系（見表8非陰影行），且與劑量率變化一致。  

 

其他組數(shù)據(jù)進一步佐證該模式：在累積劑量相近（3.6 vs 4.1 mg）但劑量率（0.4 vs 1.1 mg/L）和周期（33 vs 104周）不同的條件下，上消化道腫瘤發(fā)生率均為50-55%。31和84 mg劑量組腫瘤發(fā)生率增至95%。最高劑量組總腫瘤發(fā)生率為45%，但半數(shù)動物2周內(nèi)死亡，實際在存活至21周的動物中發(fā)生率高達90%（9/10），與31/84 mg組相當。

3.1.7 亞硝基二乙醇胺  

三項不同的大鼠致癌性研究數(shù)據(jù)符合我們的納入標準。這些研究均采用相同品系（Fisher 344），雖測試了兩種性別（雄性和雌性），但實驗時長因設(shè)計或受試物相關(guān)死亡率而存在差異。表9匯總了這三項在Fischer 344大鼠中進行的研究數(shù)據(jù)，對比了總給藥劑量與肝臟腫瘤發(fā)生率。三項經(jīng)口（飲水）途徑實施的F344大鼠研究暴露周期為45至100周，均在1984-1989年間由同一實驗室發(fā)表，研究觀察到肝臟腫瘤（主要為肝細胞腫瘤伴膽管癌）發(fā)生率上升。  

 

• Lijinsky等人（1984）將16-40只雄性和雌性F344大鼠分組暴露于含0、400、1000或2500 mg/L NDELA的飲用水中45-50周。另設(shè)一組暴露于400 mg/L濃度75周。主要研究中雌鼠日平均給藥劑量分別約為7.8、31.4和100 mg/kg/天，75周單劑量研究中雌鼠為14.4 mg/kg/天；雄鼠主要研究中約為6.02、16.8和48.4 mg/kg/天，75周單劑量研究為9.02 mg/kg/天?？倓┝浚↙CD）報告為0、2、3、5和11 g/鼠。雌鼠肝細胞癌發(fā)生率：對照組0/40，低劑量組15/16，中低劑量組16/16，中高劑量組19/20，高劑量組20/20；雄鼠發(fā)生率：對照組1/40，低劑量組14/16，中低劑量組14/16，中高劑量組18/20，高劑量組20/20。  

• Lijinsky & Kovatch（1985）將20-39只雌雄F344大鼠分組暴露于含0、28、64和160 mg/L NDELA的飲用水：低濃度組暴露100周，高濃度組50周，中濃度組分別暴露50周和100周。雌鼠日平均給藥劑量約879、1000、2010和2510 mg/kg/天，雄鼠約640、795、1460和1830 mg/kg/天。平均總劑量（LCD）報告為0、280、320、640和800 mg/鼠。雌鼠總肝腫瘤（肝細胞癌/新生結(jié)節(jié)/膽管細胞癌或腺瘤）發(fā)生率：對照組1/20，低劑量組10/39，中低劑量組5/20，中高劑量組14/20，高劑量組27/27；雄鼠發(fā)生率：對照組4/20，低劑量組6/39，中低劑量組2/20，中高劑量組11/20，高劑量組19/27。  

• Hecht等人（1989）將每組20只雌性F344大鼠暴露于含0或150 mg/L NDELA的飲用水50周。NDELA日平均劑量相當于0和2560 μg/kg/天；50周總劑量為750 mg。肝細胞腫瘤發(fā)生率：對照組0/20，NDELA組14/20。

3.1.8. N-亞硝基吡咯烷在LCDB中關(guān)于NPYR的13個致癌性數(shù)據(jù)集中，有兩項研究被確定符合我們的納入標準，這些研究涉及相同的物種、品系、性別和暴露途徑，但暴露時間和/或研究持續(xù)時間不同。在Hoos等人（1985年）的研究中，雄性Sprague-Dawley大鼠（每組80只）通過飲用水攝入相同總量NPYR（600 mg/kg），但給藥持續(xù)時間和間隔不同。具體而言，一組大鼠以1 mg/kg/天的劑量連續(xù)處理600天并在剩余壽命期接受觀察；另一組以2 mg/kg/天的劑量處理300天并在剩余壽命期接受觀察。在Berger等人（1987年）的研究中，雄性Sprague-Dawley大鼠（每組80只）通過飲用水途徑分別以0.04、0.133和0.4 mg/kg/天的劑量攝入NPYR，持續(xù)641-680天。雖然該研究因持續(xù)時間無變化而無法單獨評估LTL，但其通過引入較低劑量豐富了整體數(shù)據(jù)集，展示了該化合物良好的劑量-反應(yīng)關(guān)系。與載體對照組相比，兩項研究均觀察到腫瘤發(fā)生率升高，其中肝臟是最敏感器官。

表10匯總了研究者確定的終生累積劑量、劑量率、暴露持續(xù)時間和患腫瘤動物數(shù)量。正如預(yù)期，Berger等人（1987年）報告的低劑量組數(shù)據(jù)顯示LCD與劑量率呈近似線性相關(guān)，因這些劑量組的暴露持續(xù)時間差異極小。在Hoos等人（1985年）涉及不同暴露持續(xù)時間的兩個高劑量組中，腫瘤發(fā)生率與終生累積劑量的關(guān)聯(lián)更密切。盡管300天2 mg/kg/天劑量組的腫瘤發(fā)生率（76%）略高于600天1 mg/kg/天劑量組（66%），但差異無統(tǒng)計學意義（Hoos等，1985）。

 

3.2. 北美案例研究結(jié)果摘要  

八個北美案例研究的數(shù)據(jù)均支持以下結(jié)論：LCD（終生累積劑量）是評估腫瘤結(jié)局最合適的劑量指標，因此也是評估致癌效力的最佳依據(jù)。圖2以圖示形式展示了其中四項案例研究，清晰揭示了這種關(guān)聯(lián)。盡管所有八項研究都證實了LCD與腫瘤結(jié)局的關(guān)系，但部分數(shù)據(jù)集建模因短期高劑量給藥導致的早期死亡（進而降低腫瘤發(fā)生率）而復(fù)雜化。  

 

多數(shù)數(shù)據(jù)集的建模難點在于劑量反應(yīng)在LCD達到約80%動物患瘤率后呈現(xiàn)自然平臺期。如下文NMOR案例所示，最高兩個數(shù)據(jù)點（終生累積劑量160 mg和250 mg）未予展示，因腫瘤發(fā)生率已穩(wěn)定在90%以上。平臺效應(yīng)在其他案例中同樣存在，導致數(shù)據(jù)呈指數(shù)擬合趨勢；但通過直觀觀察可見，在較低LCD區(qū)間內(nèi)腫瘤發(fā)生率與LCD基本呈線性關(guān)系。  

所有八項研究均采用大鼠飲用水暴露實驗，持續(xù)時間21至120周不等。其中七項使用F344大鼠：三項雄性、三項雌性、一項兩性數(shù)據(jù)。第八項研究（NPYR）采用雄性Sprague-Dawley大鼠。值得注意的是：五項研究包含≤30周的致癌性實驗數(shù)據(jù)，八項均包含終生生物測定等效數(shù)據(jù)（98-120周）。多組不同周期研究由相同團隊發(fā)表，因其他變量（如物種品系、性別年齡、暴露途徑、基礎(chǔ)飲食、實驗室條件）恒定，成為理想對比樣本。  

主要靶器官包括上消化道（食道、前胃、舌、口咽）及肝臟腫瘤。這些案例清晰表明LCD與致癌效力的關(guān)聯(lián)：多個研究顯示在相似LCD下，無論劑量率或暴露時長差異，腫瘤結(jié)局均趨同。由此推論，在固定劑量率不同時長的研究中，暴露時長與腫瘤結(jié)局的關(guān)系同樣明確——這最終反映與LCD的關(guān)聯(lián)。例如：飲用水中0.45 mg/L NDEA暴露30周、60周、104周后，大鼠腫瘤發(fā)生率分別為2/20、6/20、14/20。 

需指出：盡管LCD被確定為最適用劑量指標，但部分案例（NDEA、NTHP）同時揭示暴露時長對腫瘤結(jié)局的影響遠超劑量率。以0.45 mg/L NDEA為例，暴露時長從30周增至104周（3.5倍增幅）導致腫瘤發(fā)生率提升7倍。Peto等（1991）針對NDEA的給藥時長失衡效應(yīng)已作詳細探討（見章節(jié)3.1.1）。

3.3. 其他明確致癌物：黃曲霉毒素B1除亞硝胺案例研究外，我們還獲取了涉及不同暴露時長的黃曲霉毒素B1（AFB1，CAS# 1162-65-8）嚙齒動物致癌性數(shù)據(jù)。終身致癌數(shù)據(jù)庫共收錄25項研究，涵蓋五種物種（食蟹猴、恒河猴、小鼠、大鼠及樹鼩），涉及三種給藥途徑（膳食、管飼、腹腔注射）。但僅雄性F344大鼠數(shù)據(jù)符合納入標準，具體如下。

雄性F344大鼠的三項膳食研究表明肝癌發(fā)生率升高（多數(shù)研究描述為肝細胞癌，其中一項稱為肝癌）（Nixon等，1974，1981；Wogan等，1974）。這些研究的暴露周期為52至104周；其中兩項出自同一實驗室但發(fā)表年份相隔甚遠。表11匯總了這三項膳食研究數(shù)據(jù)。最具啟發(fā)性的是Nixon等（1974，1981）的研究：大鼠通過膳食分別暴露于20ppb（104周）或50ppb（52周），終生累積劑量相近。兩組的腫瘤發(fā)生率幾乎相同（40% vs 38%），這支持了終生累積劑量比劑量率更適合作為劑量指標的假說。

 

需說明的是，雄性F344大鼠管飼研究采用極短期給藥（2-8周）（Wogan等，1971）。但該研究使用極高管飼劑量（25–70μg/次），多數(shù)劑量組出現(xiàn)100%腫瘤發(fā)生率，故無法用于定量評估。值得注意的是，這些大鼠的總給藥劑量達1000至3000μg/kg/日，與導致80–100%腫瘤發(fā)生率的慢性劑量范圍重疊，該結(jié)果與基于終生累積劑量指標的預(yù)期一致。

如表11所示，多數(shù)AFB1數(shù)據(jù)涉及慢性暴露（≥95周）。同一實驗室的50ppb（52周）與20ppb（104周）給藥研究（均于104周終止）顯示完全一致的腫瘤反應(yīng)，證實了終生累積劑量是評估致癌效能的合理指標。終身致癌數(shù)據(jù)庫中的TD50值（經(jīng)1.5節(jié)所述研究時長校正）也佐證了該結(jié)論——膳食50ppb（52周）與20ppb（104周）的TD50值極為接近（分別為0.00134 mg/kg/日與0.00113 mg/kg/日）。

3.4. 部分符合納入標準的案例研究除上述案例研究外，還有三個國家評估報告的數(shù)據(jù)部分符合我們的納入標準，可進行定性評估：4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、4-(丁基亞硝胺基)-1-丁醇和N-亞硝基-雙(2-氧丙基)胺。盡管針對每種化合物都有大量研究，但數(shù)據(jù)存在局限性，無法對累積劑量與致瘤反應(yīng)進行完整的定量比較。

然而，我們發(fā)現(xiàn)這些案例對定性評估具有參考價值，可增強線性閾值假說(LTL)的證據(jù)權(quán)重。三項案例研究均進一步支持了"累積終生劑量(LCD)是評估致瘤反應(yīng)的合適劑量指標"這一假說；重要的是，沒有任何數(shù)據(jù)引發(fā)質(zhì)疑。•煙草源性致癌物4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（更常稱為NNK，CAS RN 64091-91-4）在LCDB數(shù)據(jù)庫中有12項研究。這些研究通過皮下注射、氣管內(nèi)給藥、頰囊給藥或飲用水給藥途徑在大鼠或倉鼠中進行，持續(xù)時間從單次給藥到終生暴露不等，由不同研究團隊完成。

但這些研究的實用性有限：主要是單次劑量研究、采用非標準給藥途徑，且使用懷孕倉鼠進行實驗。Hoffmann等(1981)的研究具有一定定性參考價值：當相同終生累積劑量（約190 mg）以兩種不同劑量率/處理時長（25周內(nèi)75次×2.5 mg/劑量 vs 6.3周內(nèi)19次×10 mg/劑量）施用于敘利亞倉鼠時，雌性倉鼠的肺部及整體呼吸道腫瘤發(fā)生率相近。但雄性倉鼠在25周暴露期（每周3次×2.5 mg/劑量）比6.3周暴露期（每周3次×10 mg/劑量）出現(xiàn)更多腫瘤（肺/呼吸道腫瘤發(fā)生率100% vs 53-67%）。

研究者認為25周組腫瘤發(fā)生率升高可能與動物生存期延長相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明：相同總劑量（190 mg）在6.3周與25周暴露期產(chǎn)生的腫瘤效應(yīng)基本相當；或因生存期差異，壓縮至短暴露期（6.3周）可能降低致瘤效力。•LCDB數(shù)據(jù)庫中關(guān)于4-(丁基亞硝胺基)-1-丁醇（BBN）的7項研究存在局限性：部分劑量過高導致100%致瘤反應(yīng)；部分因早期死亡中斷；暴露時長不一或不明；使用不同大鼠品系/亞系。

盡管如此，明確劑量反應(yīng)關(guān)系仍驗證了LCD對膀胱腫瘤數(shù)量的重要性：不同實驗室使用各亞系大鼠（暴露期39-106周），總累積劑量0/17/75/86.5/128/408 mg分別引發(fā)0/0/20/67/77/100%的膀胱腫瘤發(fā)生率。•N-亞硝基-雙(2-氧丙基)胺（CAS RN 60599-38-4）的7項研究因大鼠品系和給藥途徑差異引入變異性，適合定性而非定量分析。例如Lijinsky實驗室兩項研究（雌性F344大鼠）：灌胃法（30周暴露/終生觀察）與飲用水法（50周暴露/75周觀察）顯示累積劑量158 mg與275 mg時，肝細胞癌發(fā)生率呈明確劑量依賴性（42% vs 60%），印證累積劑量的關(guān)鍵作用(Lijinsky等, 1984; Lijinsky & Reuber, 1983)。

 

4. 討論本次評估

通過嚙齒類動物致癌性研究提供實證依據(jù)，證實亞硝胺化合物（NAs）的致癌效力取決于總暴露劑量而非日劑量。這是ICH M7指南評估藥物中致突變雜質(zhì)終生暴露（LTL）的核心原則。需要指出的是，本文涉及的八例亞硝胺案例均屬低分子量亞硝胺，其結(jié)構(gòu)無法代表原料藥中復(fù)雜的大分子亞硝胺雜質(zhì)。多數(shù)藥物相關(guān)亞硝胺雜質(zhì)近期才被發(fā)現(xiàn)，因此缺乏傳統(tǒng)嚙齒動物致癌性數(shù)據(jù)來支持以劑量率或終生累積劑量（LCD）作為效力關(guān)鍵決定因素的論證（Schlingemann等2023）。

但鑒于八項案例涵蓋現(xiàn)有數(shù)據(jù)中最強效的亞硝胺，本次分析可視為"最壞情境"推演，其結(jié)果可外推至藥物相關(guān)亞硝胺的化學空間。本研究所涉亞硝胺效力跨度極大——從高效力物質(zhì)（如NMPEA，可接受攝入量AI=8ng/天；NDEA，AI=26.5ng/天）²至超越毒理學關(guān)注閾值（TTC）物質(zhì)（如NPYR，AI=1700ng/天；NDELA，AI=1900ng/天）³，每項案例均實證了以終生累積劑量作為癌癥效力基準的LTL原則。

基于此及對更廣泛化學空間LTL數(shù)據(jù)的評估（Felter等，2011），原料藥相關(guān)復(fù)雜亞硝胺很可能同樣遵循LTL原則。除八項涉及不同暴露時長/研究周期的亞硝胺案例外，黃曲霉毒素B1（另一遺傳毒性致癌物）的案例研究進一步佐證該原則適用于具有致突變作用機制的高效致癌物。值得注意的是，多數(shù)原始研究作者在呈現(xiàn)數(shù)據(jù)時已基于累積劑量關(guān)系進行整理。關(guān)鍵的是，當前沒有任何定量或定性數(shù)據(jù)對LTL原則的適用性提出質(zhì)疑。

盡管這八項案例研究僅涵蓋亞硝胺類化合物廣闊化學空間中的有限樣本，但其作為現(xiàn)有最完善的數(shù)據(jù)集，囊括了不同致癌強度等級（后續(xù)將展開討論）。值得注意的是，作為一類特殊化合物，亞硝胺擁有較其他化學品類更豐富的嚙齒類動物致癌性數(shù)據(jù)，這些研究采用不同暴露周期和/或?qū)嶒灂r長的方案。

這既因公共衛(wèi)生界早在1950年代（遠早于標準化實驗規(guī)程建立之時）就已關(guān)注亞硝胺風險，也因多種亞硝胺化合物被用作化學致癌基礎(chǔ)研究的模型物質(zhì)（包括給藥方案與實驗周期的影響）。因此，多數(shù)評估暴露周期與/或?qū)嶒灂r長影響的亞硝胺嚙齒動物致癌研究由相同團隊完成，從而在排除其他致癌強度干擾變量的條件下實現(xiàn)了嚴謹對比。但需指出，大量現(xiàn)有研究未必能為"累積劑量是否最適用作劑量指標"的評估提供有效依據(jù)。令人意外的是，盡管NDMA（N-亞硝基二甲胺）擁有大量研究數(shù)據(jù)（致癌性數(shù)據(jù)庫收錄22項），卻無一項符合本研究納入標準。

鑒于ICH M7指南中致突變雜質(zhì)的可接受攝入量（AIs）基于TD50值設(shè)定，我們簡述了TD50的計算方法，特別是針對非終身每日給藥、實驗周期短于或長于標準兩年致癌實驗的嚙齒動物研究如何進行定量調(diào)整（參見第1.5節(jié)）。這些調(diào)整最終確定的AI值旨在確保終身每日暴露的理論風險不超過十萬分之一?？紤]到人類暴露時長存在短期至慢性的巨大差異，ICH M7指南（2023）提出了短期暴露下的AI限值上調(diào)方法——通過隨暴露周期遞減而遞增的安全系數(shù)實現(xiàn)。

在比較不同持續(xù)時間的嚙齒動物致癌性數(shù)據(jù)以評估給藥/研究時長的影響時，可參考已發(fā)表的TD50值。黃曲霉毒素B1的案例顯示：52周50 ppb飲食給藥與104周20 ppb飲食給藥的TD50值高度接近（分別為0.00134 mg/kg/天和0.00113 mg/kg/天）。但我們發(fā)現(xiàn)更有價值的是分析各案例的實際腫瘤發(fā)生率數(shù)據(jù)，評估LCD（最低致癌劑量）與腫瘤結(jié)局的關(guān)系——這正是LTL（終生暴露極限）概念的基礎(chǔ)。

本文研究的8個遺傳毒性致癌物（NA）案例覆蓋21至120周的研究時長，涵蓋短至標準嚙齒動物壽命5%的給藥場景。某些超短期給藥研究因高劑量導致過早死亡而被排除，因其無法定量評估致癌效力。黃曲霉毒素B1案例與8個NA案例共同代表了廣泛的效力范圍（黃曲霉毒素B1效力最強），覆蓋CPCA第1-4類別及現(xiàn)有基于化合物特異性致癌數(shù)據(jù)的監(jiān)管AI值。

盡管這些案例強有力證實LCD是NA的合適劑量指標（黃曲霉毒素B1數(shù)據(jù)表明該原則同樣適用于高效致癌物），但監(jiān)管機構(gòu)對ICH M7指南中LTL調(diào)整因子應(yīng)用于藥物NA雜質(zhì)的適用性仍存疑慮，主要包括：

• 單次暴露誘發(fā)腫瘤的研究評估（主要采用新生小鼠模型）

• 允許終生劑量壓縮至超短周期時潛在DNA修復(fù)超載風險

• 多重用藥導致的暴露量增加風險

• 支持ICH M7指南特定LTL調(diào)整因子及治療時長分類應(yīng)用于NA雜質(zhì)的數(shù)據(jù)充分性

此外，需評估慢性間歇性暴露是否符合ICH M7指南的LTL原則（即允許攝入量應(yīng)以總給藥天數(shù)而非給藥時間間隔為基準，且給藥天數(shù)需關(guān)聯(lián)相應(yīng)時長類別）。我們將持續(xù)研究間歇性暴露的其他評估方法，以完善ICH M7指南對NA雜質(zhì)的適用性。

 

5. 總結(jié)與結(jié)論

本文探討了關(guān)于ICH M7指南中LTL暴露于藥品NA雜質(zhì)適用性的核心問題——是否存在可參照LTL概念基礎(chǔ)前提評估的NA致癌性數(shù)據(jù)：即致癌效力取決于總暴露量而非日劑量。為解答該問題，本研究從LCDB數(shù)據(jù)庫中提取了涉及不同暴露時長/研究周期的NA嚙齒類致癌性數(shù)據(jù)，并依據(jù)合著者共識制定的納入標準（要求致癌數(shù)據(jù)來自同物種、品系、性別及暴露途徑，最可靠對比需源于同一實驗室且針對相同靶器官）進行評估。

針對八項符合納入標準的NA案例研究進行了嚴格評估；同時納入另一種高效力致癌物黃曲霉毒素B1的數(shù)據(jù)。案例研究涵蓋廣泛效力范圍的NA及21至120周的研究周期。所有案例均發(fā)現(xiàn)致癌效力與動物接受的總劑量相關(guān)，與日劑量或劑量率無關(guān)——這直接回應(yīng)了關(guān)于ICH M7方法處理LTL暴露適用性的關(guān)鍵問題。值得注意的是，現(xiàn)有數(shù)據(jù)（定性與定量）均未對LTL原則的適用性提出質(zhì)疑。

盡管基礎(chǔ)問題已通過實證數(shù)據(jù)得到解答，但在NA風險評估中應(yīng)用LTL原則仍需解決若干問題以達成共識：包括單劑量NA致癌研究、多藥并用考慮、LTL較高限度是否可能導致超出DNA修復(fù)/解毒機制的暴露水平，以及現(xiàn)有ICH M7指南中LTL分級（表1）的適用性依據(jù)。這些持續(xù)研究領(lǐng)域?qū)⒘硇邪l(fā)表，最終為ICH M7亞工作組（近期成立以制定《亞硝胺雜質(zhì)風險評估與控制》附錄，補充《DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)評估與控制指南》）提供科學支持，旨在完善亞硝胺雜質(zhì)安全評估及控制標準建立工作。