40多年前胚胎干細(xì)胞（ESC）的發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)快速發(fā)展，其體外無限增殖與多向分化能力為細(xì)胞治療奠定基礎(chǔ)。2006年誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）的誕生，進(jìn)一步豐富細(xì)胞治療工具庫，可從非胚胎來源獲取目標(biāo)細(xì)胞，降低倫理爭議。
全球人多能干細(xì)胞（hPSC）相關(guān)臨床試驗(yàn)數(shù)量快速增長，截至2024年底已達(dá)115項(xiàng)。其中，人iPSC（hiPSC）為基礎(chǔ)的試驗(yàn)占比顯著提升，目前約占所有干細(xì)胞研究的60%。
盡管研究熱度高，尚無hPSC衍生產(chǎn)品獲批商業(yè)化應(yīng)用，而成人干細(xì)胞衍生或含成人干細(xì)胞的產(chǎn)品已有40多種上市。hPSC技術(shù)較新，臨床應(yīng)用前需克服的安全壁壘遠(yuǎn)高于其他細(xì)胞治療產(chǎn)品。
hPSC衍生細(xì)胞治療產(chǎn)品（CTP）的安全擔(dān)憂主要集中于兩大特性，這是其臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵障礙：1）殘留未分化hPSC致畸胎瘤風(fēng)險(xiǎn)。最終產(chǎn)品中若殘留未分化hPSC，其在體內(nèi)具有極強(qiáng)的畸胎瘤形成能力，可能導(dǎo)致嚴(yán)重不良事件。目前僅報(bào)道1例—2型糖尿病患者接受hiPSC衍生β細(xì)胞治療后2個(gè)月，出現(xiàn)hiPSC來源畸胎瘤并伴隨局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，凸顯該風(fēng)險(xiǎn)的現(xiàn)實(shí)性。可以通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，全面評估hPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、心肌細(xì)胞及CAR-NK/ILC細(xì)胞的畸胎瘤形成風(fēng)險(xiǎn)，常用免疫缺陷嚙齒類動(dòng)物檢測體內(nèi)形成潛力，用流式細(xì)胞術(shù)、qPCR等檢測產(chǎn)品中殘留未分化細(xì)胞；2）基因組不穩(wěn)定性與成瘤性。未分化hPSC在體外培養(yǎng)或分化過程中，可能出現(xiàn)基因組突變、拷貝數(shù)變異等不穩(wěn)定性，進(jìn)而增加細(xì)胞的成瘤潛力，這也是監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)注的核心風(fēng)險(xiǎn)之一。
2015-2024年的7份hESC/hiPSC衍生產(chǎn)品科學(xué)建議報(bào)告顯示，早期多通過“專項(xiàng)體內(nèi)成瘤性研究”或“含成瘤性終點(diǎn)的一般毒性研究”評估畸胎瘤風(fēng)險(xiǎn)。近期趨勢發(fā)生轉(zhuǎn)變，企業(yè)逐漸依賴現(xiàn)有文獻(xiàn)、體外數(shù)據(jù)等，來證明無需開展體內(nèi)研究，減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依賴。不過，無論如何，為確保臨床安全，hPSC衍生細(xì)胞需達(dá)到預(yù)期分化階段；生產(chǎn)過程中必須采用嚴(yán)格方法證明“殘留未分化hPSC已清除”，方可提交監(jiān)管審批。
2015年底，健康與環(huán)境科學(xué)研究所（HESI）成立“細(xì)胞治療-追蹤、循環(huán)與安全（CT-TRACS）委員會(huì)”，成員涵蓋澳、歐、日、英、美40多個(gè)公私機(jī)構(gòu)，共同解決細(xì)胞治療的安全與開發(fā)難題。該委員會(huì)發(fā)文全面概述了hPSC衍生CTP成瘤性的潛在風(fēng)險(xiǎn)，重點(diǎn)聚焦“殘留未分化hPSC”這一核心風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，并總結(jié)了當(dāng)前可用于緩解這些風(fēng)險(xiǎn)的體外檢測方法，通過對比體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)方法的靈敏度，為hPSC衍生CTP成瘤性風(fēng)險(xiǎn)的最優(yōu)評估策略提供指導(dǎo)。
hPSC衍生CTP的成瘤風(fēng)險(xiǎn)概述
在討論殘留未分化hPSC之前，有必要先審視人多能干細(xì)胞衍生細(xì)胞治療產(chǎn)品（hPSC-derived CTPs）整體的潛在成瘤風(fēng)險(xiǎn)。下表總結(jié)了2019年HESICT-TRACS委員會(huì)立場文件中基于專家意見提出的潛在風(fēng)險(xiǎn)及相應(yīng)緩解策略。
在人多能干細(xì)胞系建立或產(chǎn)品制造過程中，基因組異常積累后可能出現(xiàn)非預(yù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這是該類細(xì)胞治療產(chǎn)品成瘤性的額外潛在風(fēng)險(xiǎn)。背景體細(xì)胞突變受供體細(xì)胞類型和年齡影響，而重編程過程中對已存在癌癥驅(qū)動(dòng)突變的潛在篩選，可能進(jìn)一步增加成瘤風(fēng)險(xiǎn)。
目前有多種體外檢測方法可評估基因組完整性或細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況，可通過下一代測序（NGS）及近年出現(xiàn)的糾錯(cuò)型NGS，對基因組單核苷酸變異和拷貝數(shù)變異進(jìn)行檢測，以發(fā)現(xiàn)基因組改變。核型分析、熒光原位雜交或比較基因組雜交可用于檢測大片段染色體異常。對于基因修飾產(chǎn)品（如CAR-T細(xì)胞），可通過插入位點(diǎn)分析評估插入性突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)。可對惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征（如永生化、轉(zhuǎn)錄變化、生長促進(jìn)、錨定依賴性（貼壁細(xì)胞）、生長因子非依賴性（T細(xì)胞產(chǎn)品））進(jìn)行評估，以識(shí)別非預(yù)期轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
當(dāng)然，該領(lǐng)域在檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化方面面臨重大挑戰(zhàn)與機(jī)遇，因?yàn)椴⒎撬袡z測方法都有全球統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方案。
hPSC殘留評估
殘留hPSC的分類界定
在hPSC衍生CTPs中，“雜質(zhì)（impurities）”“污染物（contaminants）”“殘留細(xì)胞（residual cells）”常被互換用于描述殘留未分化hPSC，但從監(jiān)管角度，三者控制嚴(yán)格程度不同。
ICH Q6B法規(guī)依據(jù)：該法規(guī)雖未涵蓋CTPs，但對“雜質(zhì)”和“污染物”有明確定義。雜質(zhì)分為“工藝相關(guān)雜質(zhì)”（如細(xì)胞底物、培養(yǎng)過程產(chǎn)物）和“產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)”（如制造/儲(chǔ)存中產(chǎn)生的分子變體、前體及降解產(chǎn)物）；污染物指非預(yù)期引入的制造無關(guān)物質(zhì)。據(jù)此，殘留未分化hPSC更符合“產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)”定義。
其他地區(qū)法規(guī)參考：歐盟先進(jìn)治療醫(yī)藥產(chǎn)品法規(guī)中，若藥物活性成分定義為分化細(xì)胞群，祖細(xì)胞類型被歸為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)；加拿大CTP指南將具有不良生長潛力的細(xì)胞列為雜質(zhì)。綜合來看，殘留未分化hPSC應(yīng)被歸類為“雜質(zhì)”而非“污染物”。
因殘留未分化hPSC有極高畸胎瘤形成潛力，最終產(chǎn)品中其可耐受量需嚴(yán)格限制，并通過設(shè)定盡可能靈敏的可接受標(biāo)準(zhǔn)證明合理性。
殘留hPSC的體內(nèi)檢測方法
1.體內(nèi)檢測的法規(guī)要求
hPSC衍生CTPs因存在畸胎瘤形成和基因組異常風(fēng)險(xiǎn)，成瘤性高于人體體細(xì)胞或成體干細(xì)胞衍生產(chǎn)品。進(jìn)入臨床試驗(yàn)前，通常需開展非臨床體內(nèi)成瘤性研究，觀察周期需覆蓋實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命（如免疫缺陷嚙齒類約9-12個(gè)月），或直至CTPs從動(dòng)物體內(nèi)清除。
2.核心檢測方法：畸胎瘤形成試驗(yàn)
該試驗(yàn)是評估hPSC多能性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過向免疫缺陷動(dòng)物注射特定數(shù)量hPSC，監(jiān)測數(shù)周至數(shù)月內(nèi)畸胎瘤形成情況，但其存在成本高、耗時(shí)長、需專業(yè)技術(shù)的局限。以下為試驗(yàn)設(shè)計(jì)關(guān)鍵影響因素：
動(dòng)物模型：常用模型包括T細(xì)胞缺陷裸鼠、T/B細(xì)胞雙缺陷SCID鼠、T/B細(xì)胞缺陷且NK細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活性降低的NOD/SCID鼠，以及T/B/NK細(xì)胞均缺陷且巨噬細(xì)胞/樹突狀細(xì)胞功能異常的NOG/NSG鼠。其中NOG/NSG鼠移植成功率最高，且有研究顯示，其與具有功能性人類免疫細(xì)胞的Hu-CD34 NSG鼠相比，畸胎瘤生長速率和病理特征無差異。
細(xì)胞解離方式：單細(xì)胞解離是實(shí)現(xiàn)hPSC定量移植的關(guān)鍵，但單細(xì)胞易凋亡，需更高數(shù)量才能形成畸胎瘤。可通過共注射細(xì)胞外基質(zhì)（如Matrigel）或絲裂霉素滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞，提升解離后hPSC的植入效率。
注射部位：不同部位畸胎瘤形成率差異顯著。腎包膜注射形成率最高（100%），其次為含Matrigel的皮下注射（94%）、睪丸內(nèi)注射（60%）、無Matrigel的皮下注射（33%）、肌肉內(nèi)注射（12.5%）。皮下注射因操作簡便、便于觀察，是最常用部位。
3.體內(nèi)檢測的敏感性評估
試驗(yàn)設(shè)計(jì)（動(dòng)物模型、細(xì)胞解離、注射部位等）和細(xì)胞來源均會(huì)影響畸胎瘤形成，而畸胎瘤形成所需hPSC的最小數(shù)量，是評估體內(nèi)檢測敏感性的核心指標(biāo)。
皮下注射：向免疫缺陷裸鼠注射1×106hESC可誘導(dǎo)畸胎瘤；若hPSC與Matrigel、飼養(yǎng)細(xì)胞共注射，1×102hESC即可在NOD/SCID鼠中形成畸胎瘤；NOG鼠中，hiPSC形成畸胎瘤的50%腫瘤產(chǎn)生劑量（TPD50）為102.12個(gè)細(xì)胞；加入ROCK抑制劑（Y-27632，抑制hPSC解離凋亡）可進(jìn)一步提高畸胎瘤形成率。
其他部位：腎包膜、肌肉、睪丸等部位注射所需hPSC最小數(shù)量高于皮下注射。
臨床等效部位考量：監(jiān)管要求體內(nèi)試驗(yàn)需采用與臨床接近的給藥途徑，但目前多數(shù)hPSC衍生CTPs的臨床研究集中于惡性腫瘤、心血管疾病、眼部退行性疾病、神經(jīng)退行性疾病，其臨床移植部位（如靜脈、心肌內(nèi)、視網(wǎng)膜下）對應(yīng)的畸胎瘤形成所需hPSC數(shù)量（如>1×10?），高于皮下注射“金標(biāo)準(zhǔn)”所需數(shù)量，且神經(jīng)組織移植的hPSC最小畸胎瘤形成數(shù)量暫無明確報(bào)道。
4.體內(nèi)成瘤性檢測的局限性
最優(yōu)條件下（向NOG/NSG鼠皮下注射，聯(lián)用細(xì)胞外基質(zhì)、飼養(yǎng)細(xì)胞、ROCK抑制劑），體內(nèi)檢測可發(fā)現(xiàn)低至1×10²個(gè)殘留hPSC，但受嚙齒類動(dòng)物最大可行劑量（MFD，1-5×10?個(gè)細(xì)胞）限制，其敏感性僅為0.0002%-0.001%，與現(xiàn)有體外檢測敏感性相當(dāng)或更低。
若臨床移植部位為眼部或中樞神經(jīng)系統(tǒng)，動(dòng)物試驗(yàn)的MFD會(huì)顯著降低（如視網(wǎng)膜下移植僅1.5×10?個(gè)細(xì)胞，脊髓/紋狀體注射僅2-5×10?個(gè)細(xì)胞），直接導(dǎo)致檢測敏感性下降。
為符合監(jiān)管申報(bào)要求，體內(nèi)試驗(yàn)需使用與臨床一致的細(xì)胞制劑，無法聯(lián)用Matrigel、飼養(yǎng)細(xì)胞、ROCK抑制劑，進(jìn)一步降低了畸胎瘤形成的可檢測性。
殘留hPSC的體外檢測方法
體外檢測的核心背景與原則
倫理與法規(guī)驅(qū)動(dòng)：減少動(dòng)物痛苦是倫理研究的核心，且體內(nèi)畸胎瘤檢測敏感性不足，因此體外檢測成為重要替代方案。
監(jiān)管認(rèn)可度提升：美國FDA等機(jī)構(gòu)逐漸認(rèn)可體外檢測數(shù)據(jù)，認(rèn)為其可在特定條件下替代體內(nèi)檢測，預(yù)測成瘤風(fēng)險(xiǎn)。
檢測技術(shù)分類：體外檢測主要基于三類原理，分別是檢測hPSC特異性RNA、檢測hPSC特異性表面標(biāo)志物、檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中hPSC特異性成分，以及通過高效培養(yǎng)體系直接檢測未分化hPSC（不同文獻(xiàn)來源的hPSC體外檢測數(shù)據(jù)匯總?cè)缦卤硭荆扑]將這些高敏感性檢測納入CTP安全性評估）。
各類體外檢測方法詳情
1.hPSC特異性RNA檢測
通過PCR技術(shù)檢測未分化hPSC特有的基因轉(zhuǎn)錄本，核心是選擇合適的標(biāo)志物并搭配高靈敏的擴(kuò)增方法。
標(biāo)志物選擇：
常用核心標(biāo)志物為LIN28A，被建議作為CTP安全性評估的hPSC特異性標(biāo)志物。
為應(yīng)對基因表達(dá)異質(zhì)性，需搭配其他標(biāo)志物，如針對hiPSC衍生心肌細(xì)胞的ESRG、LINC00678等，針對皮膚成纖維細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等的特異性基因，以及l(fā)ncRNA、miRNA。
檢測方法與敏感性：
qPCR：檢測限（LOD）最低可達(dá)0.001%，但對高循環(huán)閾值（Ct>29）的mRNA定量能力較弱。
dPCR：LOD最低可達(dá)0.0001%，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，可直接輸出絕對值，對微量mRNA定量更穩(wěn)健、靈敏。
RT-LAMP：可處理更多樣本量（最多100μgDNA或5μgRNA），抗干擾能力強(qiáng)，使用多標(biāo)志物時(shí)LOD可達(dá)0.00002%。
局限性：僅能檢測表達(dá)目標(biāo)標(biāo)志物的細(xì)胞，可能遺漏低表達(dá)或不表達(dá)標(biāo)志物的殘留hPSC；且只能提供群體平均數(shù)據(jù)，無單細(xì)胞分辨率。
2.hPSC特異性表面標(biāo)志物檢測
通過抗體或特殊標(biāo)記識(shí)別未分化hPSC表面的蛋白質(zhì)或糖結(jié)構(gòu)，核心是平衡檢測速度與敏感性。
流式細(xì)胞術(shù)：需新鮮單細(xì)胞樣本，結(jié)果依賴門控策略，LOD約為0.1%，敏感性較低，多用于研究而非質(zhì)量控制。
表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）：用標(biāo)記金納米顆粒結(jié)合SSEA-5/TRA-1-60抗體，LOD可達(dá)0.0001%，是表面標(biāo)志物檢測中最靈敏的方法，但仍需單細(xì)胞懸液。
糖脂糖鏈檢測：通過糖印跡法檢測hPSC特異性糖脂糖鏈（如Gb3、SSEA-4），僅需1000個(gè)細(xì)胞，但LOD約為0.25%，敏感性低于其他體外方法。
3.細(xì)胞培養(yǎng)液中hPSC特異性成分檢測
屬于非侵入性檢測，無需破壞CTP樣本，適合珍貴移植材料的檢測。
糖蛋白檢測（GlycoStem試驗(yàn)）：檢測hPSC分泌的足糖萼蛋白，優(yōu)化后的GlycoStem-HP試驗(yàn)，在hiPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞背景下LOD為0.05%。
培養(yǎng)液中miRNA檢測：檢測hPSC釋放到培養(yǎng)液中的特異性miRNA（如miR-302家族），qPCR法在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞背景下LOD可達(dá)0.001%，但部分檢測僅為定性，不適合質(zhì)量控制。
4.未分化hPSC高效培養(yǎng)體系（HEC試驗(yàn)）
直接檢測具有增殖能力的未分化hPSC，不依賴標(biāo)志物，是獨(dú)特的功能型檢測方法。
核心原理：在特定條件（層粘連蛋白-521包被板、Essential8培養(yǎng)基）下培養(yǎng)CTP一周，擴(kuò)增未分化hPSC后計(jì)數(shù)克隆數(shù)。
敏感性與優(yōu)化：
基礎(chǔ)HEC試驗(yàn)：在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞背景下LOD為0.001%，經(jīng)多中心驗(yàn)證（如MEASURE項(xiàng)目）穩(wěn)定性良好。
聯(lián)合磁珠分選（MACS）：用抗TRA-1-60磁珠富集hPSC后，在T細(xì)胞背景下LOD可達(dá)0.00002%。
改良培養(yǎng)條件：在hiPSC衍生心肌細(xì)胞背景下，無需富集即可達(dá)到0.0005%的LOD。
優(yōu)勢與局限性：可直接檢測增殖性未分化hPSC，敏感性與PCR法相當(dāng)；但耗時(shí)較長，是各類體外檢測中操作周期相對久的方法。
檢測方法的國際標(biāo)準(zhǔn)化推進(jìn)
HESICT-TRACS委員會(huì)聯(lián)合日本MEASURE項(xiàng)目，開展多中心研究，評估并優(yōu)化體外檢測方法。目前已將dPCR和HEC試驗(yàn)作為核心候選，推動(dòng)其成為殘留hPSC體外成瘤性檢測的國際標(biāo)準(zhǔn)方法，解決當(dāng)前缺乏統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)的問題。
dPCR檢測與HEC檢測的多中心研究詳情
dPCR作為高敏感性殘留hPSC檢測方法，研究通過“兩步兩臂”設(shè)計(jì)，解決多實(shí)驗(yàn)室間的檢測差異性問題，具體如下：
1.研究設(shè)計(jì)與流程
Step1（僅dPCR檢測差異性評估）：
由單個(gè)實(shí)驗(yàn)室制備“摻雜樣本”（含特定濃度未分化hiPSC的RNA樣本），并分發(fā)給各參與實(shí)驗(yàn)室。各實(shí)驗(yàn)室僅開展dPCR分析，檢測CNMD、ESRG等7個(gè)標(biāo)志物基因，評估單一環(huán)節(jié)的檢測變異性。
Step2（全流程差異性評估，分兩臂）：
Arm1：向各實(shí)驗(yàn)室分發(fā)hiPSC和hiPSC衍生心肌細(xì)胞（iCM），由實(shí)驗(yàn)室自行完成“細(xì)胞摻雜→RNA提取→dPCR檢測”全流程，僅評估3個(gè)選定標(biāo)志物基因，不使用內(nèi)參基因。
Arm2：各實(shí)驗(yàn)室解凍冷凍保存的hiPSC和iCM，自行完成全流程，檢測9-10個(gè)標(biāo)志物基因及1個(gè)內(nèi)參基因，目前結(jié)果已完成待單獨(dú)發(fā)表。
2.關(guān)鍵研究結(jié)果（Step1與Step2 Arm1）
標(biāo)志物基因篩選：通過回歸分析、精密度、檢測限（LOD）等參數(shù)評分，從7個(gè)基因中篩選出ESRG、LINC00678、LIN28A3個(gè)最優(yōu)標(biāo)志物。
檢測敏感性：成功檢測到濃度低至0.0003%的未分化hiPSC。
變異性來源定位：Step2 Arm1的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性，均高于Step1。實(shí)驗(yàn)室間差異的核心來源是hiPSC摻雜步驟，而非dPCR檢測本身。建議在確定CTP中hPSC雜質(zhì)的LOD時(shí)，需重點(diǎn)考慮細(xì)胞摻雜的實(shí)驗(yàn)室間差異，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部引入dPCR檢測時(shí)。
HEC檢測的多中心研究
HEC檢測通過培養(yǎng)擴(kuò)增未分化hPSC并計(jì)數(shù)集落，研究在4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室開展，驗(yàn)證其敏感性與再現(xiàn)性。
1.研究設(shè)計(jì)與流程
樣本制備：將hiPSC以0.0005%或0.0015%的濃度，摻雜到iCM中。
培養(yǎng)與檢測：在特定條件下培養(yǎng)7天后，通過堿性磷酸酶（ALP，hPSC特征標(biāo)志物）染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)hiPSC集落數(shù)量。
評估指標(biāo)：驗(yàn)證不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測敏感性、陽性檢出率（TPR）及結(jié)果重復(fù)性。
2.關(guān)鍵研究結(jié)果
檢測敏感性：所有實(shí)驗(yàn)室均成功檢出低至“1×10?個(gè)iCM中摻雜5個(gè)hiPSC”的樣本，即LOD達(dá)到0.0005%。
特異性：未摻雜hiPSC的樣本中，無實(shí)驗(yàn)室檢出ALP陽性集落，特異性良好。
陽性檢出率（TPR）：檢測0.0005%濃度hiPSC時(shí)，平均TPR為92%，且所有實(shí)驗(yàn)室兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的TPR均接近100%。
結(jié)果穩(wěn)定性：
實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重復(fù)性變異系數(shù)為24%-36%，實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性變異系數(shù)為36%-44%，證明方法穩(wěn)健性高。
再現(xiàn)性差異主要源于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重復(fù)性，核心影響因素仍是hiPSC摻雜步驟。
優(yōu)化策略：使用“色原酮1、依米立酮、多胺、反式ISRIB”的小分子混合物（替代ROCK抑制劑），可提升hiPSC存活率，進(jìn)一步提高檢測敏感性。
兩種方法的核心結(jié)論
方法互補(bǔ)性：dPCR（基于RNA標(biāo)志物）與HEC（基于細(xì)胞增殖能力）為正交方法，前者檢測基因表達(dá)，后者直接檢測功能活性細(xì)胞，可從不同維度評估殘留hPSC風(fēng)險(xiǎn)。
應(yīng)用建議：兩種方法均具有高敏感性和多中心驗(yàn)證的穩(wěn)健性，研究發(fā)起者可根據(jù)自身CTP類型及樣本特性，選擇最適合的質(zhì)量控制方法。
討論
體內(nèi)畸胎瘤檢測的敏感性差異
體內(nèi)畸胎瘤檢測用于檢測殘留未分化hPSCs的敏感性，會(huì)因檢測方案、動(dòng)物模型和移植方法不同而存在差異。文獻(xiàn)表明，當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、飼養(yǎng)細(xì)胞和ROCK抑制劑共同皮下移植到重度免疫缺陷嚙齒動(dòng)物（如NSG小鼠、NOG小鼠）體內(nèi)時(shí)，檢測敏感性最高，預(yù)估在0.0002%–0.001%之間。但如果為模擬臨床制劑而不聯(lián)合移植，則敏感性會(huì)顯著降低。
這一結(jié)果說明，現(xiàn)有體外檢測的敏感性高于體內(nèi)檢測，尤其是在采用符合監(jiān)管申報(bào)要求的方法（如模擬預(yù)期臨床制劑和移植部位）時(shí)。HESICT-TRACS已啟動(dòng)國際多中心研究，評估高敏感性體外檢測（包括基于dPCR的檢測和HEC檢測）的可行性。該研究以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞（iCMs）為背景細(xì)胞，結(jié)果顯示兩種檢測均具有穩(wěn)健性和足夠敏感性，可作為體內(nèi)檢測的替代方案（檢測限分別為0.0003%–0.001%和0.0005%）。
監(jiān)管要求與體外檢測的替代建議
美國、歐盟和日本的監(jiān)管指南（如下表所示）通常要求通過體內(nèi)成瘤性研究，評估人多能干細(xì)胞衍生細(xì)胞治療產(chǎn)品（CTPs）形成畸胎瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)，但也鼓勵(lì)將體外和/或離體方法作為體內(nèi)研究的補(bǔ)充。
然而，基于上述原因，HESICT-TRACS建議：若能建立經(jīng)驗(yàn)證且敏感性更高的體外檢測（如基于dPCR的檢測和HEC檢測），可采用體外檢測替代體內(nèi)檢測。
體外檢測的敏感性驗(yàn)證與注意事項(xiàng)
需通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)評估每種產(chǎn)品體外檢測的敏感性效率，且檢測限需確認(rèn)與體內(nèi)檢測報(bào)告值相當(dāng)或更低。
HESICT-TRACS的多中心研究表明，人多能干細(xì)胞懸液的準(zhǔn)確制備和樣本加標(biāo)，是評估檢測敏感性和精密度的關(guān)鍵。人多能干細(xì)胞加標(biāo)步驟是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室間差異的主要原因，因此需在產(chǎn)品檢測所在機(jī)構(gòu)確定檢測限。
加標(biāo)到人多能干細(xì)胞產(chǎn)品中的細(xì)胞系差異可能影響檢測結(jié)果（尤其在HEC檢測中），因此需使用每種產(chǎn)品的起始材料人多能干細(xì)胞系進(jìn)行檢測驗(yàn)證（尤其是確定檢測限時(shí)）。若使用多種不同人多能干細(xì)胞系作為起始材料，驗(yàn)證過程中需考慮潛在的批次間差異。
體外檢測的選擇與標(biāo)志物考量
每種體外檢測（包括基于dPCR的檢測和HEC檢測）均有其優(yōu)勢、劣勢和局限性，因此需針對每種細(xì)胞治療產(chǎn)品，謹(jǐn)慎評估檢測方法的選擇。
通過檢測人多能干細(xì)胞特異性標(biāo)志物來識(shí)別未分化細(xì)胞時(shí)，LIN28A是敏感性較高的標(biāo)志物，已用于心肌細(xì)胞、多巴胺祖細(xì)胞、CAR-NK/ILC細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)品的臨床試驗(yàn)準(zhǔn)入質(zhì)量檢測。
但有研究指出，LIN28A不適用于某些細(xì)胞類型（如肝細(xì)胞），因?yàn)樗粌H在未分化細(xì)胞中表達(dá)，也會(huì)在相應(yīng)的分化細(xì)胞中表達(dá)。
標(biāo)志物的通用性與局限性方面。已有研究基于RNA-seq數(shù)據(jù)提出了識(shí)別潛在標(biāo)志物的策略，也有少數(shù)研究探索了通用人多能干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，但這些研究僅在少數(shù)代表性分化細(xì)胞中驗(yàn)證了標(biāo)志物，尚未證明其對所有細(xì)胞治療產(chǎn)品的適用性。部分標(biāo)志物在分化過程中會(huì)下調(diào)，這意味著即使是同一細(xì)胞譜系的產(chǎn)品，若細(xì)胞處于低分化狀態(tài)，為特定細(xì)胞譜系驗(yàn)證的標(biāo)志物也可能無法有效發(fā)揮作用。由于標(biāo)志物的特異性和線性依賴于背景細(xì)胞，其檢測限也會(huì)隨之變化，因此需為每種細(xì)胞治療產(chǎn)品選擇合適的標(biāo)志物并進(jìn)行驗(yàn)證。
HEC檢測的特點(diǎn)與局限性方面。HEC檢測不依賴人多能干細(xì)胞內(nèi)/表面表達(dá)的特異性RNA或表面蛋白標(biāo)志物，可直接檢測未分化人多能干細(xì)胞。盡管該檢測需要1周的培養(yǎng)時(shí)間，但有研究表明它適用于懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞等多種類型，因此可廣泛應(yīng)用于人多能干細(xì)胞衍生細(xì)胞治療產(chǎn)品。HEC檢測的局限性主要包括兩點(diǎn)：無法用于會(huì)產(chǎn)生影響未分化人多能干細(xì)胞存活的因子的細(xì)胞治療產(chǎn)品，例如hiPSC衍生RPE細(xì)胞分泌的色素上皮衍生因子。這類產(chǎn)品中殘留未分化人多能干細(xì)胞的潛在風(fēng)險(xiǎn)通常較低，但由于集落形成效率不足，無法通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)確定準(zhǔn)確檢測限。不適用于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生腎祖細(xì)胞，因?yàn)檫@類部分分化的細(xì)胞可在HEC檢測的培養(yǎng)基中生長。
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