過程點微生物檢測方法
1、目的
2、范圍
適用于生產(chǎn)過程中的微生物檢測。
3、工作程序
3.1 測試方法
采用膜過濾測試法（采用濾膜為0.45um）。
3.2培養(yǎng)基和試劑
3.2.1伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(用于測試過程點的大腸菌群)
稱取37.5g伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基溶于1L蒸餾水中,加熱溶解，121℃15分鐘高壓滅菌。最好根據(jù)樣品數(shù)量配制培養(yǎng)基，現(xiàn)配現(xiàn)用，一次性用完；若一次用不完，放在冰箱內(nèi)保存，第二次再用時，需重新滅菌。
3.2.2乳糖膽鹽培養(yǎng)基配制方法（檢驗樣品中的大腸菌群）
稱取35g乳糖膽鹽培養(yǎng)基溶于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分別裝于有倒立發(fā)酵管的試管中，115℃，15分鐘，高壓滅菌，現(xiàn)用現(xiàn)配，一次用完。
3.2.3平板計數(shù)瓊脂(用于測試過程點的細菌總數(shù))用電子稱準確稱取23.5g平板計數(shù)瓊脂溶于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝，121℃15分鐘高壓滅菌。最好根據(jù)樣品數(shù)量配制培養(yǎng)基，現(xiàn)配現(xiàn)用，一次性用完；若一次用不完，放在冰箱內(nèi)保存，第二次再用時，需重新滅菌。
3.2.4馬鈴薯葡萄糖瓊脂(用于測試過程點的霉/酵母菌)
用電子稱準確稱取38g馬鈴薯葡萄糖瓊脂溶于1L蒸餾水中, 加熱煮沸至完全溶解、分裝，121℃15分鐘高壓滅菌。最好根據(jù)樣品數(shù)量配制培養(yǎng)基，現(xiàn)配現(xiàn)用，一次性用完；若一次用不完，放在冰箱內(nèi)保存，第二次再用時，需重新滅菌。
3.2.5若培養(yǎng)基經(jīng)過消毒后已凝固,使用之前需將裝有培養(yǎng)基的瓶子放在微波爐進行溶解培養(yǎng)基滅菌后，應在無菌室超凈工作臺內(nèi)采用火焰消毒操作法往每個培養(yǎng)皿中倒入16-18毫升培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)皿倒置放入冰箱備用。
3.3取樣方法
3.3.1容器和管道沖洗水的取樣方法：用無菌三角瓶取沖洗容器、管道后殘留的新鮮水樣500毫升。
3.3.2容器和管道內(nèi)樣品（調(diào)和液、炭濾后水、砂濾后水、儲水罐原水等）的取樣方法：
首先用75%的酒精棉認真擦拭取樣口，然后用無菌三角瓶火焰下取樣500毫升。
3.3.3壓縮空氣的取樣方法：打開取樣口快速放出適量氣體，用酒精棉認真擦拭取樣口，然后用火焰直接燒一下取樣口至酒精全干，再調(diào)節(jié)氣體流速（至不吹跑營養(yǎng)瓊脂平板），打開事先準備好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板的蓋，暴露在離取樣口10-15cm距離處的氣流中，緩慢地旋轉培養(yǎng)皿，暴露一分鐘后蓋上蓋即可。
3.3.4室內(nèi)空氣的取樣方法：用事先一天倒好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，在室內(nèi)空氣不流動時，打開培養(yǎng)皿蓋在空氣中暴露30分鐘，然后蓋上蓋即可。
3.3.5固體原材料的取樣方法：用無菌鋼勺，取適量樣品，無菌操作下，裝入一無菌瓶中，在無菌室加入300ml無菌水，搖勻后檢測。
3.3.6容器內(nèi)壁和設備表面的取樣方法：首先用75%的酒精棉擦拭雙手和取樣用鑷子，取適量濕無菌棉擦拭容器內(nèi)壁或設備表面（6*6cm2），擦拭后迅速放入無菌瓶中，在無菌室加入300ml無菌水，搖勻后檢測。
3.4做樣
將膜過濾支架放在超凈工作臺上，確定其閥門處于關閉狀態(tài)，用火焰對其上端進行滅菌，在取用已經(jīng)滅菌的濾器（牛皮紙包裹121℃滅菌15分鐘）之前，用酒精棉球擦拭雙手，安裝濾斗，將鑷子在酒精燈火焰區(qū)滅菌，待涼后，開啟無菌濾膜的外包裝，用鑷子夾取濾膜置于濾斗上，安裝濾杯，注意刻度向外，夾上彈簧夾，取300毫升樣品倒入濾杯，啟動抽濾泵，馬上開啟閥門過濾，過濾完畢后，關閉抽濾泵，取下彈簧夾，拿下濾杯，用酒精棉球擦拭剪刀，與鑷子一起在酒精燈火焰區(qū)滅菌，待涼后，用鑷子夾住，用剪刀將濾膜均勻剪成三部分，取一小部分置于帶有伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；取一部分置于帶有平板計數(shù)瓊脂的培養(yǎng)皿中；取一部分置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂的培養(yǎng)皿中。
3.5培養(yǎng)
將帶有伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，倒置于36℃～38℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，24±2小時后記錄結果；將帶有平板計數(shù)瓊脂的培養(yǎng)皿，倒置于36℃～38℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，48±2小時后記錄結果，將帶有馬鈴薯葡萄糖瓊脂的培養(yǎng)皿，倒置于25℃～28℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，72小時后開始觀察，120小時后記錄結果。
3.6報告
a.細菌平板：對濾膜上的菌落總數(shù)進行計數(shù)，以每100毫升所含菌落總數(shù)表示。
b.大腸菌群：對有可疑大腸菌群特征的菌落（紫紅色中間帶金屬光澤的菌落）進行計數(shù)，并挑取此種菌落1～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖復發(fā)酵管，置于36℃～38℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小時，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。或采用3M大腸菌群培養(yǎng)基快速培養(yǎng)。
c.霉/酵母菌平板：對濾膜上的菌落總數(shù)進行計數(shù)，以每100毫升所含菌落總數(shù)表示。
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