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2015年9月23日，臺(tái)灣地區(qū)“衛(wèi)福部”發(fā)布部授食字第1041901616號(hào)公告，修正“食品中霉菌毒素檢驗(yàn)方法－黃曲毒素之檢驗(yàn)” 全文2點(diǎn)，并自即日生效。

1.適用范圍：本檢驗(yàn)方法適用于香辛料、油脂、花生、玉米、谷類(lèi)及其制品中黃曲毒素B1、B2、G1及G2的檢驗(yàn)。

2.檢驗(yàn)方法：檢體經(jīng)萃取及凈化后，以高效液相層析儀（high performance liquid chromatograph, HPLC）分析的方法。

2.1.裝置：

2.1.1.高效液相層析儀：

2.1.1.1.檢出器：熒光檢出器（fluorescence detector）。

2.1.1.2.層析管：Cosmosil5C18-AR，5μm，內(nèi)徑4.6mm×25cm，或同級(jí)品。

2.1.1.3.光化學(xué)反應(yīng)器：Knitted Reactor Coils（KRC）25-25，或同級(jí)品。

2.1.2.均質(zhì)機(jī)（Homogenizer）：轉(zhuǎn)速可達(dá)15000rpm以上并適用有機(jī)溶劑者。

2.1.3.粉碎機(jī)（Grinder）。

2.2.試藥：氯化鈉及Tween-20均采用試藥特級(jí)；甲醇采用液相層析級(jí)；去離子水（比電阻于25℃可達(dá)18MΩ‧cm以上）；黃曲毒素B1、B2、G1及G2對(duì)照用混合標(biāo)準(zhǔn)品（濃度分別為1000、300、1000及300ng/mL）。

2.3.器具及材料：

2.3.1.離心管：50mL，PP材質(zhì)。

2.3.2.容量瓶：2mL、10mL及20mL，褐色。

2.3.3.濾膜：孔徑0.22μm，Nylon材質(zhì)。

2.3.4.濾紙：WhatmanNo.1，直徑11cm，或同級(jí)品。

2.3.5.玻璃纖維濾紙（Glass microfiber filters）：直徑9cm。

2.3.6.免疫親和性管柱（Immuno affinity column）：采用內(nèi)含對(duì)黃曲毒素B1、B2、G1及G2具專(zhuān)一性單株抗體之Afla Test-P管柱，或同級(jí)品。

2.3.7.針筒過(guò)濾器（Syringefilter）：濾膜孔徑0.22μm，PTFE材質(zhì)。

2.4.試劑之調(diào)制：

2.4.1.50%甲醇溶液：

取甲醇與去離子水以50：50（v/v）之比例混勻。

2.4.2.60%甲醇溶液：

取甲醇與去離子水以60：40（v/v）之比例混勻。

2.4.3.80%甲醇溶液：

取甲醇與去離子水以80：20（v/v）之比例混勻。

2.4.4.10%Tween-20溶液：

取Tween-20與去離子水以10：90（v/v）之比例混勻。

2.5.移動(dòng)相溶液之調(diào)制：

取甲醇與去離子水以45：55（v/v）之比例混勻后，經(jīng)濾膜過(guò)濾，取濾液供作移動(dòng)相溶液。

2.6.標(biāo)準(zhǔn)溶液之配制：

精確量取黃曲毒素B1、B2、G1及G2對(duì)照用混合標(biāo)準(zhǔn)品1mL，以50%甲醇溶液稀釋并定容至20mL，作為標(biāo)準(zhǔn)原液。臨用時(shí)取適量標(biāo)準(zhǔn)原液，以50%甲醇溶液稀釋黃曲毒素B1及G1至0.1～50ng/mL，黃曲毒素B2及G2至0.05～15ng/mL，供作標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.7.檢液之調(diào)制：

2.7.1.玉米、谷類(lèi)及其制品：

將檢體磨碎混勻后，取約50g，精確稱(chēng)定，置于均質(zhì)機(jī)中，加入氯化鈉5g及80%甲醇溶液100mL，以15000rpm均質(zhì)2分鐘，經(jīng)濾紙過(guò)濾。精確量取濾液10mL，加去離子水40mL混勻，以玻璃纖維濾紙過(guò)濾。精確量取濾液10mL，注入免疫親和管柱（流速控制1滴／秒），待濾液完全通過(guò)管柱后，以去離子水10mL流洗2次（流速控制1滴／秒），棄流出液，再以甲醇1mL沖提（流速控制1滴／秒），收集沖提液，以去離子水定容至2mL，經(jīng)針筒過(guò)濾器過(guò)濾，供作檢液。

2.7.2.油脂、花生及其制品：

將油脂等液態(tài)檢體直接混勻，其他檢體經(jīng)磨碎混勻后，取約25g，精確稱(chēng)定，置于均質(zhì)機(jī)中，加入氯化鈉5g及60%甲醇溶液125mL，以15000rpm均質(zhì)2分鐘后，經(jīng)濾紙過(guò)濾。精確量取濾液10mL，加去離子水30mL混勻，以玻璃纖維濾紙過(guò)濾。精確量取濾液20mL，注入免疫親和管柱（流速控制1滴／秒），待濾液完全通過(guò)管柱后，以去離子水10mL流洗2次（流速控制1滴／秒），棄流出液，再以甲醇1mL沖提（流速控制1滴／秒），收集沖提液，以去離子水定容至2mL，經(jīng)針筒過(guò)濾器過(guò)濾，供作檢液。

2.7.3.香辛料：

將檢體磨碎混勻后，取約25g，精確稱(chēng)定，置于均質(zhì)機(jī)中，加入氯化鈉5g及80%甲醇溶液100mL，以15000rpm均質(zhì)2分鐘，經(jīng)濾紙過(guò)濾。精確量取濾液5mL，加10%Tween-20溶液20mL混勻，以玻璃纖維濾紙過(guò)濾。精確量取濾液4mL，注入免疫親和管柱（流速控制1滴／秒），待濾液完全通過(guò)管柱后，以去離子水10mL流洗2次（流速控制1滴／秒），棄流出液，再以甲醇1mL沖提（流速控制1滴／秒），收集沖提液，以去離子水定容至2mL，經(jīng)針筒過(guò)濾器過(guò)濾，供作檢液。

2.8.鑒別試驗(yàn)及含量測(cè)定：

精確量取檢液及標(biāo)準(zhǔn)溶液各50μL，分別注入高效液相層析儀中，依下列條件進(jìn)行液相層析，就檢液與標(biāo)準(zhǔn)溶液所得波峰之滯留時(shí)間比較鑒別之，并依下列計(jì)算式求出檢體中各黃曲毒素之含量（ppb）：

Ｃ×Ｖ×Ｆ

檢體中各黃曲毒素含量（ppb）＝ ────

Ｍ

C：由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得檢液中各黃曲毒素之濃度（ng/mL）

V：檢體最后定容之體積（mL）

F：依2.7.1.節(jié)取樣分析時(shí)，F為50

依2.7.2.節(jié)取樣分析時(shí)，F為25

依2.7.3.節(jié)取樣分析時(shí)，F為125

M：取樣分析檢體之重量（g）

高效液相層析測(cè)定條件：

層析管柱：Cosmosil5C18-AR，5μm，內(nèi)徑4.6mm×25cm。

光化學(xué)反應(yīng)器：KRC25-25。

熒光檢出器：激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm。

移動(dòng)相溶液：依2.5.節(jié)所調(diào)制之溶液。

移動(dòng)相流速：1.0mL/min。

附注：1.本檢驗(yàn)方法之定量極限，于油脂、花生、玉米、谷類(lèi)及其制品中，黃曲毒素B1及G1均為0.2ppb，黃曲毒素B2及G2均為0.1ppb；于香辛料中，黃曲毒素B1及G1均為1ppb，黃曲毒素B2及G2均為0.5ppb。

2.食品中有影響檢驗(yàn)結(jié)果之物質(zhì)時(shí)，應(yīng)自行探討。

3.以液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC/MS/MS）進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，其LC/MS/MS之多重反應(yīng)偵測(cè)（multiplereactionmonitoring,MRM）模式參考參數(shù)如下表。

分析物

離子化模式

離子對(duì)

去集簇電壓（V）

碰撞電壓（eV）

前驅(qū)離子（m/z）＞產(chǎn)物離子（m/z）

黃曲毒素B1

ESI+

313＞241*

313＞285

48

48

36

22

黃曲毒素B2

ESI+

315＞259*

315＞287

46

46

28

26

黃曲毒素G1

ESI+

329＞200*

29＞243

46

46

42

26

黃曲毒素G2

ESI+

331＞189*

331＞313

48

48

42

24

*定量離子對(duì)

注：上述測(cè)定條件分析不適時(shí)，依所使用之儀器，設(shè)定適合之測(cè)定條件。

參考文獻(xiàn)

1.Vicam,AflatestHPLCinstructionmanual.Milford,MA,USA.

2.卓憲駿、陳映君、廖家鼎、曾素香、高雅敏、周秀冠、陳惠芳。2014。香辛料中黃曲毒素之檢驗(yàn)方法開(kāi)發(fā)及調(diào)查。衛(wèi)生福利部食品藥物管理署2014年度研究成果報(bào)告。

廈門(mén)WTO工作站編

2015.9.24