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近年來，由于人們生活水平和健康意識的提高，酸奶已成為一種深受廣大消費(fèi)者喜愛的乳制品之一，但其在生產(chǎn)制作或運(yùn)輸過程中如儲存不當(dāng)，會使當(dāng)中乳酸菌的數(shù)量減少，而酸奶營養(yǎng)價(jià)值主要來源于其中乳酸菌的數(shù)量多少，故酸奶中活性乳酸菌的數(shù)量減少直接影響酸奶的質(zhì)量[1]。確計(jì)數(shù)活性乳酸菌制品中的乳酸菌，衛(wèi)生部于2010年發(fā)布了修訂版《食品微生物檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》GB 4789.35-2010[2]，與2008版相比修訂版中修改了乳酸菌總數(shù)、乳桿、雙岐桿菌、嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)方法。但該標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了一種平板涂布法作為檢測樣品中乳酸菌數(shù)量的方法，且要求操作者從樣品稀釋到平板涂布在15分鐘內(nèi)必須完成。筆者以多年從事乳酸菌數(shù)量檢測工作經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，對于少量樣品的檢測，按照國標(biāo)來操作是完全可以實(shí)現(xiàn)的，但在實(shí)際工作中，往往由于種種原因的限制，對于大樣本大樣本量(n>20)，仍采用國際來進(jìn)行檢測，具有非常大的實(shí)際困難。因此，本文從市面上隨機(jī)選取6種品牌的酸奶，通過比較平板涂布法與傾注培養(yǎng)法之間的差異，以及不同稀釋液結(jié)果比較，以保證真實(shí)反映酸奶中乳酸菌數(shù)量可供進(jìn)一步修改國標(biāo)的參考依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 隨機(jī)選擇6份不同商品名的含活性乳酸菌含量較高、均勻性較好的酸奶制品。

　　1.1.2 稀釋液：(1)生理鹽水、(2)PBS緩沖液、(3)CYS緩沖液(L-半胱氨酸磷酸鹽緩沖液:L-半胱氨酸鹽酸鹽0.20g，磷酸氫二鈉2.40g，磷酸二氫鉀1.80g，吐溫800.24g，于400mL純化水中，攪拌使其充分溶解;以NaOH溶液調(diào)pH為6.8~7.0，滅菌條件121℃、15min)。

　　1.2方法

　　1.2.1 平板法：將上述樣品根據(jù)待檢樣品活菌數(shù)估計(jì)，選擇2~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1mL樣品勻液分別置于2個MRS瓊脂平板，使用L形玻璃棒進(jìn)行表面均勻涂布，每個稀釋度更換一個L形玻璃棒。同時(shí)做空白對照。

　　1.2.2 傾注法：將上述樣品根據(jù)待檢樣品活菌數(shù)估計(jì)，選擇2~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1mL樣品勻液分別置于2個空培養(yǎng)皿中，傾入50℃左右的MRS瓊脂約20mL，輕輕振搖混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平皿。

　　1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析：采用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，用數(shù)據(jù)表示，采用“兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)”以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

　　2 結(jié)果：

　　2.1涂布法和傾注法對乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響

　　樣品稀釋過程按照GB 4789.35-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)操作，分別進(jìn)行平板涂布和常規(guī)傾注進(jìn)行培養(yǎng)。分別采用涂布法和傾注法，以稀釋時(shí)間為立即，對六份樣品中乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果見表1。

　　6份樣品分別用傾注法和涂布法所得的乳酸菌數(shù)結(jié)果從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上均無差別。

　　2.2 三種稀釋液中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果比較

　　6份樣品經(jīng)不同稀釋液稀釋后分別采用涂布法對乳酸菌測定的結(jié)果見表2。

　　3. 討論：

　　本實(shí)驗(yàn)采用成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)檢驗(yàn)(Independent Sample t Test)分析方法，對6種市售酸奶制品分別采用涂布法和傾注法來計(jì)數(shù)酸奶中乳酸菌菌落數(shù)，結(jié)果表明，該兩種方法測得的結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)研究結(jié)果顯示，涂布法和傾注法對乳酸菌計(jì)數(shù)無影響是一致的。涂布法培養(yǎng)后乳酸菌生長在瓊脂表面，便于挑取菌種做驗(yàn)證試驗(yàn)和保存菌種等，但缺點(diǎn)是其樣品稀釋液用L形棒涂布必須均勻否則乳酸菌生長不均對結(jié)果造成影響[4]傾注法為常規(guī)檢測方法即樣品加樣后再傾注培養(yǎng)基混勻進(jìn)行培養(yǎng)，技術(shù)操作簡便，樣品混勻后能均勻生長，然而培養(yǎng)后菌落大多生長在瓊脂內(nèi)部，如需鑒定試驗(yàn)時(shí)會帶來一定的困難。另外，通過優(yōu)化方法不同稀釋液中結(jié)果比較，6份樣品在CYS緩沖液中結(jié)果較高。由于生理鹽水沒有緩沖能力，會導(dǎo)致某些樣品不能夠溶解和分散充分，影響最終的計(jì)數(shù)結(jié)果。PBS和CYS中磷酸鹽可提供緩沖能力，而CYS中L半胱氨酸能夠?yàn)槿樗峋纳L提供還原性的環(huán)境，吐溫80能夠使菌體分散更充分，為乳酸菌生長提供有利環(huán)境。

　　綜上所述，若在一批檢測樣本數(shù)量較多的情況下，僅要求對乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)的條件下，筆者建議可采用傾注法培養(yǎng)。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)表明傾注法與國標(biāo)推薦的涂布法對乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且傾注法在操作技術(shù)上優(yōu)于涂布法，可大大縮短操作時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外將CYS作為稀釋液更適用于益生菌食品中乳酸菌檢驗(yàn)，建議在國標(biāo)修訂時(shí)可考慮更換稀釋液。