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嘉峪檢測網(wǎng) 2017-04-25 16:00
大腸菌群衛(wèi)生學(xué)意義
大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評價樣品中是否受到糞便的污染。大腸菌群是理想的糞便污染的指標(biāo)菌，大腸菌群計數(shù)的高低，直接反映了樣品受糞便污染的程度。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名，而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。它們之間的生化特征及血清學(xué)反應(yīng)并非完全一致。一般認(rèn)為這群細(xì)菌包括：大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌。
標(biāo)準(zhǔn)修訂情況
1984年首次頒布 GB/T 4789.3-84《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 大腸菌群測定》。1994、2003、2008、2010和2016分別公布新的版本。
目前GB/T 4789.3-2003這一版本還在繼續(xù)使用。GB/T 4789.3-2003的特點：選取1-2個可疑菌落進(jìn)行染色和復(fù)發(fā)酵，挑取菌落數(shù)偏低，檢驗武斷性較大。3-5%大腸菌群在EMB上可形成不典型菌落。另一方面，形成典型菌落的也未必是大腸菌群。所以，方法對檢驗者經(jīng)驗要求比較高。
GB 4789.3-2016 變化及解讀
封面
變化：標(biāo)準(zhǔn)刪除了標(biāo)準(zhǔn)的英文名稱
解讀：這是2012年之后的固定做法。
變化：修改了發(fā)布單位名稱，由“中華人民共和國衛(wèi)生部”改為“中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會”和“國家食品藥品監(jiān)督管理總局”。
前言
變化：寫的比較明確，替代的各標(biāo)準(zhǔn)以及標(biāo)準(zhǔn)的主要變化都寫了。
沒有寫出來的變化是修改了圖1 大腸菌群MPN計數(shù)法檢驗程序和樣品的稀釋方法。
另外以往歷次版本全部被刪掉了，這點與2010版不同。
1 范圍
變化：修改了第二段適用范圍： “本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群計數(shù)；第二法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群計數(shù)”，這里邊所謂的含量較高、較低一般以100CFU作為界限。100CFU以上采用第二法，100CFU以下采用第一法。
2 術(shù)語和定義
變化：僅僅是把英文名的首字母大寫了。
存在的問題：
這其中存在的爭議主要是“發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”中間不需要頓號。
3 檢驗原理
變化：2016版新增章節(jié)。
存在的問題：
3.1 “應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。”這句話有點小問題。建議應(yīng)該描述為：應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)概率推算出待測樣品中大腸菌群的最可能數(shù)。定義中MPN為最可能數(shù)而不是最大可能數(shù)。
3.2 平板計數(shù)法的描述不像是解釋檢驗原理，因為這句話看起來僅僅是描述形成典型菌落的原理。
4 設(shè)備和材料
存在的問題：
4.6只寫了振蕩器不夠，例如冷凍樣品化凍需要恒溫震蕩水浴，梯度稀釋最好采用旋渦混合儀；
4.10“pH計或pH比色管或精密pH試紙”中“精密pH試紙”不太好用，對于有顏色樣品和有顏色的培養(yǎng)基不允許使用“精密pH試紙”來測量pH，因為會受到基質(zhì)顏色的干擾影響pH判斷。
5 培養(yǎng)基和試劑
變化：將原來每個英文單詞大寫的首字母，改成了小寫。
解讀：這才符合英文的習(xí)慣用法。
變化：5.6、5.7分別刪除了氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液前面的“無菌”兩個字。
解讀：高壓滅菌過程會導(dǎo)致鹽酸揮發(fā)，并且這兩種試劑本來就是無菌狀態(tài)。
第一法 大腸菌群MPN計數(shù)法
方法適用范圍：MPN適用于污染比較輕微的樣品。對于污染菌量太多的樣品，還是平板計數(shù)法更有優(yōu)勢；相對于平板計數(shù)法來說，檢驗結(jié)果不夠準(zhǔn)確。
6 檢驗程序
變化：在圖1里面，將LST肉湯初發(fā)酵培養(yǎng)時間由48 h±2 h改為24 h～48 h。
解讀：這樣才跟正文中間規(guī)定的兩次觀察時間能夠吻合。
存在的問題：最后一個框圖中，報告結(jié)果改成了結(jié)果報告，還是與其他GB 4789系列標(biāo)準(zhǔn)都是規(guī)定為“報告”不一致。
7 操作步驟
變化：7.1.2 增加了“或其它無菌容器中充分振搖或置于機(jī)械振蕩器中振搖”。
解讀：這樣的修訂，滿足了一般實驗室常常使用漩渦混合儀等手段混合液體樣品的需求。
變化：7.2 在復(fù)發(fā)酵試驗后面增加了“證實試驗”四個字。但是后面48 h的那個復(fù)發(fā)酵試驗，又沒有增加。
變化：7.3 復(fù)發(fā)酵試驗
增加了“證實試驗”作為標(biāo)題。跟前面對應(yīng)。
變化：7.4 將確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)改為BGLB陽性管數(shù)。
解讀：這樣是跟實際操作情況相一致的。
建議：
1）.7.1.1樣品的稀釋建議大家采用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，可以認(rèn)為是商業(yè)化培養(yǎng)基并且具有一定的pH調(diào)節(jié)作用。
常見錯誤：
1）.7.1.3實驗室應(yīng)有pH調(diào)節(jié)記錄，即使pH不需要調(diào)節(jié)就在6.5-7.5之間也應(yīng)有pH檢測記錄。
2）.7.1.5“……從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。”因為大腸、腸桿菌科等都是20min分裂一次，所以操作一定要在15min之內(nèi)。
注意事項：
發(fā)酵實驗判定原則：只要有肉眼可見的氣泡就算（包括特別小的氣泡）需進(jìn)行下一步復(fù)發(fā)酵；試管明顯渾濁但無氣泡不要著急判為陰性，需每根試管拿起來輕彈看是否有氣泡延管壁上行；含有碳酸氣的食品需特別注意判斷氣泡來源，以免造成誤判。
第二法 大腸菌群平板計數(shù)法
方法適用范圍：相對于MPN法，平板計數(shù)法檢驗結(jié)果更精確；適合用于污染比較嚴(yán)重的樣品，但對于污染菌量太少的樣品，還是MPN法更有優(yōu)勢。
8 檢驗程序
變化：第二法圖2第三個框圖中，將“接種VRBA平板”修改為“傾注VRBA平板”
解讀：這樣的描述明顯更為明確。
9 操作步驟
9.2 沒有改動。
但是有兩個遺留問題：
9.2.1“同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿做空白對照。”這里規(guī)定使用生理鹽水明顯不符合實際情況，因為也可能使用磷酸鹽緩沖液。應(yīng)該描述為同時取1 mL無菌稀釋液加入無菌平皿做空白對照。
9.2.2 在（VRBA）后面多了一個“約”字。這是2010版本就錯誤的地方，這次還沒有修改。
變化：9.3 增加了“（如菌落直徑較典型菌落小。）”和“最低稀釋度平板低于15 CFU的記錄具體菌落數(shù)。”
解讀：現(xiàn)在這樣的描述當(dāng)然是更細(xì)致了，但是還是缺少平板菌落數(shù)超過150 CFU的情況該如何選擇的描述。
存在的問題：老問題是CFU這個縮略語出現(xiàn)太突兀，沒有說明這個縮略語的含義。
變化：9.4 增加了“少于十個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。”
解讀：這個條款的常見問題在于，多數(shù)實驗室挑取10個典型和可疑菌落的比例，并沒有按照在平板上觀察到的典型和可疑菌落比例進(jìn)行，會導(dǎo)致最終換算結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。
變化：9.5 增加了“若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。”
建議：這里還應(yīng)該加上，包括證實實驗，菌落均不是大腸菌群陽性的。
常見問題：
1）9.3規(guī)定“……分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落…”原始記錄沒有分別記錄這兩項的都是不符合規(guī)定的。
附錄
變化：附錄A 主要是文本格式修改，把培養(yǎng)基的pH放在制法里面了。
存在的問題：
但是，關(guān)于LST肉湯和BGLB肉湯，因為含有乳糖，使用121℃高壓15 min是否會分解乳糖導(dǎo)致結(jié)果假陽性，還需要進(jìn)一步證實。
規(guī)定VRBA融化并恒溫至45℃～50℃傾注平板。按照慣例，45℃溫度太低了，瓊脂常常部分凝固，描述為46℃～50℃比較合適。
存在的問題：
A.4 磷酸鹽緩沖液與前面章節(jié)中“5.4 無菌磷酸鹽緩沖液”，名字不一致，差了“無菌”兩個字。并且跟A.5 無菌生理鹽水的寫法不一致了。
變化：A.6和A.7試劑名稱和制法都有修訂，不僅是描述更為準(zhǔn)確了，而且刪除了必須121℃高壓滅菌的步驟，避免了鹽酸等腐蝕性化學(xué)物質(zhì)的揮發(fā)。
附錄B 僅僅有文本格式有修改。
來源：AnyTesting
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