植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定BJS 201707
1 范圍
本方法規(guī)定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鑒定的實時熒光PCR方法。
本方法適用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等復(fù)合植物蛋白飲料中標(biāo)識含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的檢測及鑒定。
2 原理
提取試樣中基因組DNA，以DNA為模板，利用物種特異性引物及探針進(jìn)行實時熒光PCR擴增檢測，同時設(shè)置陽性、陰性及空白對照。根據(jù)擴增的Ct值，判定試樣中是否含有該源性成分。
3試劑和材料
除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB 6682的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。
3.1核桃源性成分Jugr2基因檢測用引物對序列為：
核桃5’端引物：5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’
核桃3’端引物：5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’
核桃探針：5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’
3.2花生源性成分Ara b2基因檢測用引物（對）序列為：
花生5’端引物：5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’
花生3’端引物：5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’
花生探針：5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’
3.3 杏仁源性成分Prudul基因檢測用引物（對）序列為：
杏仁5’端引物：5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’
杏仁3’端引物：5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’
杏仁探針：5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3’
3.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因檢測用引物（對）序列為：
芝麻5’端引物：5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’
芝麻3’端引物：5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’
芝麻探針：5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3’
3.5榛子源性成分oleosin基因檢測用引物（對）序列為：
榛子5’端引物：5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’
榛子3’端引物：5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’
榛子探針：5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3’
3.6大豆源性成分Lectin基因檢測用引物（對）序列為：
大豆5’端引物：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’
大豆3’端引物：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’
大豆探針：5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3’
3.7真核生物18SrRNA內(nèi)參照檢測用引物（對）序列為：
內(nèi)參照5’端引物： 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’
內(nèi)參照3’端引物： 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’
內(nèi)參照探針：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3’
3.8 CTAB緩沖液：55 mmol/L CTAB，1400mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，
用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH 至8.0，121℃高壓滅菌20 min, 備用。
3.9 蛋白酶K：20mg/mL。
3.10苯酚：氯仿：異戊醇（體積比：25:24:1）。
3.11 異丙醇。
3.12 70%乙醇。
3.13 Taq DNA聚合酶。
3.14 dNTP混合液。
3.15 TE緩沖液（Tris-HCl、EDTA緩沖液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。
3.16 10×PCR緩沖液：200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）。
4儀器和設(shè)備
4.1 組織研磨器。
4.2 核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。
4.3 恒溫水浴鍋。
4.4 離心機：離心力12,000g。
4.5 微量移液器（0.5μL~10μL，10μL~100μL，10μL~200μL，100μL~1000μL）。
4.6 實時熒光PCR儀。
4.7 渦旋振蕩器。
4.8 天平：感量0.01g。
5分析步驟
5.1 試樣總DNA的提取
固體樣品：將樣品粉碎后稱取0.3~0.6 g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取試劑盒提取DNA。
液體樣品：取1 mL 樣品于Eppordorf管中，加入1 倍體積的異丙醇，混合均勻，室溫下沉淀5 min，室溫下以12,500 rpm 離心5 min，棄去上清液。重復(fù)此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA?？砂聪铝蟹椒ㄌ崛NA，也可用等效商品化DNA提取試劑盒提取DNA。
?。?）將處理后的樣品加入2 mL離心管中，加入600 μL CTAB緩沖液和40 μL蛋白酶K溶液，振蕩混勻，65℃孵育1 h（過夜孵育更好）， 期間每隔10 min振蕩混勻；
?。?）加入500 μL的苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），振蕩抽提10 min，室溫下以12,500 rpm 離心10 min；
?。?）小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇，振蕩均勻，12,500 rpm 離心10 min；
?。?）棄去上清液，用65℃預(yù)熱的TE緩沖液溶解DNA；
?。?）小心吸取上清，加入200 μL氯仿：異戊醇（24:1），振蕩抽提，室溫下以12500 rpm 離心15 min；
?。?）小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇，振蕩均勻，12,500rpm 離心10 min；
?。?）棄去上清液，沉淀用70% 乙醇洗滌，離心1min，晾干，溶于50μLTE 緩沖液中。
5.2 DNA濃度和純度的測定
取1μL DNA溶液，使用核酸蛋白分析儀檢測其濃度及質(zhì)量，OD260/280值應(yīng)在1.7~1.9之間時，適宜于PCR擴增。
5.3 實時熒光PCR擴增
反應(yīng)體系總體積為25μL，其中10×PCR緩沖液5μL，正反向引物（10μmol/L）各1μL，探針（10μmol/L）1μL，dNTPs（10μmol/L）2μL ，Taq DNA聚合酶（2.5U）0.2 μL，DNA模板（10-100ng/μL）2μL，用滅菌去離子水補足至總體積25μL。真核生物內(nèi)參照的反應(yīng)體系同上，僅替換相應(yīng)的引物和探針。也可使用相應(yīng)的商品化擴增試劑盒。
反應(yīng)參數(shù)：50℃ 2min； 95℃ 15min； 95℃ 15s， 60℃ 1min， 40個循環(huán)。
5.4 實驗對照
檢驗過程分別設(shè)陽性對照、陰性對照、空白對照。以相應(yīng)植物源物種提取的DNA為陽性對照，以已知不含該植物源的物種DNA為陰性對照，以滅菌水為空白對照。樣品、內(nèi)參照和對照設(shè)置兩個平行的反應(yīng)體系。
6結(jié)果判斷與表述
6.1 質(zhì)量控制
以下條件有一條不滿足時，結(jié)果視為無效：
?。╝）空白對照：無FAM熒光信號檢出；
（b）陰性對照：無FAM熒光信號檢出；
（c）陽性對照：有FAM熒光信號檢出，且FAM通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值≤35.0；
?。╠）內(nèi)參對照：有熒光對數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，相應(yīng)的Ct值＜30.0。
6.2 結(jié)果判定
?。╝）如Ct值≤35.0，則判定為被檢樣品陽性；
（b）如Ct值≥40.0，則判定為被檢樣品陰性；
?。╟）如35.0＜Ct值＜40.0，則重復(fù)試驗一次。如再次擴增后Ct值仍為35.0＜Ct值＜40.0，則判定被檢樣品可疑。
6.3 結(jié)果表述
結(jié)果為陽性者，結(jié)合產(chǎn)品標(biāo)識，表述為“檢出XX源性成分”。
結(jié)果為陰性者，結(jié)合產(chǎn)品標(biāo)識，表述為“未檢出XX源性成分”。
結(jié)果為可疑者，結(jié)合產(chǎn)品標(biāo)識，表述為“XX源性成分可疑”。
7防污染措施
檢測過程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的規(guī)定執(zhí)行。
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