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諾如病毒（Norovirus，NoVs），又稱諾瓦克病毒，是一組形態(tài)類似、抗原略有不同的病毒顆粒?？筛腥救撕蛣游镆鸺毙阅c胃炎、冬季嘔吐性疾病、胃腸性流感等，主要表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、惡心、腹痛腹瀉等，是非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原體之一。

 

諾如病毒 (norovirus，NoVs)是1972年美國學(xué)者 Kapikian在諾瓦克鎮(zhèn)的腹瀉患者糞便中首次發(fā)現(xiàn)并命名為諾瓦克病毒 (norwalk virus，NV)，隨后在第八屆國際病毒命名委員會上將該病毒命名為諾如病毒。NoVs是引起人感染性胃腸炎疫情暴發(fā)和嬰幼兒急性腹瀉的主要病原體之一。在全世界范圍內(nèi)，約73%~95%的急性胃腸炎疫情暴發(fā)與NoVs有關(guān)。其中引起人類感染的主要是 GI和 GII型諾如病毒 。

 

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，腹瀉病造成每年5.5億人患病和23萬例死亡。兒童處于食源性腹瀉病的特別危險，每年有2.2億人患病和9.6萬人死亡。諾如病毒感染性腹瀉在全世界范圍內(nèi)均有流行，全年均可發(fā)生感染，感染對象主要是成人和學(xué)齡兒童，寒冷季節(jié)呈現(xiàn)高發(fā)。美國每年在所有的非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)中，60-90%是由諾如病毒引起。荷蘭、英國、日本、澳大利亞等發(fā)達(dá)國家也都有類似結(jié)果。在中國5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢出率為15%左右，血清抗體水平調(diào)查表明中國人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。諾如病毒常見于牡蠣和其他貝類海產(chǎn)品，其抵抗力較強(qiáng)，在60℃高溫或經(jīng)快速汽蒸仍可存活。諾如病毒感染最常見的癥狀是腹瀉、嘔吐、反胃、惡心和胃痛，其他包括發(fā)熱、頭痛和全身酸痛等。

 

人類是人諾如病毒已知的唯一的宿主，患者和隱性感染者均為本病的傳染源。諾如病毒是傳染性很強(qiáng)的病毒，感染劑量為約18PFU（10-100）。諾如病毒的傳播途徑主要有人傳人（接觸）、食源性傳播和水源性傳播。對于食源性傳播來說，主要涉及貝類、水果和堅果。

 

1 諾如病毒檢測技術(shù)對比

食源性病毒是以食物為載體，導(dǎo)致人類患病的病毒。食源性病毒一直難以得到及時有效的監(jiān)控，不僅對食品衛(wèi)生和人民健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，也對食 品工業(yè)和國民經(jīng)濟(jì)造成很大的影響。目前，以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的PCR 方法成已為食源性病毒檢測的主要方法。下圖是不同檢測技術(shù)的對比。

 

2 GB 4789.42-2016諾如病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)介紹

我國政府十分重視食品安全問題，對于諾如病毒的檢測制定了非常詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)，名為GB 4789.42—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 諾如病毒檢驗。GB 4789.42—2016標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中諾如病毒的實時熒光RT-PCR檢測方法，此標(biāo)準(zhǔn)適用于貝類，生食蔬菜,胡蘿卜、瓜、堅果等硬質(zhì)表面食品,草莓、西紅柿、葡萄等軟質(zhì)水果等食品中諾如病毒核酸的檢測。

GB 4789.42—2016中對檢測諾如病毒所需要的材料有著詳細(xì)的限定，分別包括實時熒光PCR儀、低溫冰箱、微量移液器、網(wǎng)狀過濾袋、無菌棉拭子、無菌剪刀、無菌鉗子、pH計或pH試紙、無菌刀片或等效均質(zhì)器、離心機(jī)。而對于試劑，GB 4789.42—2016中注明除有特殊說明外,所有實驗用試劑均為分析純，實驗用水均為無RNase超純水。對于檢測程序的要求，GB 4789.42—2016以圖表的形式清晰的展現(xiàn)了出來。

 

2.1 病毒提取 

標(biāo)準(zhǔn)中對樣品中的諾如病毒提取明確了步驟和要求，需要注意的是過程控制病毒應(yīng)該加入到樣品中，如做硬質(zhì)表面檢測時過程控制病毒應(yīng)加入棉簽上，在貝類消化腺檢測中應(yīng)該加入到消化腺勻漿的中央，軟質(zhì)水果和生食蔬菜同樣應(yīng)該加入樣品中，然后進(jìn)行病毒提取。

 

諾如病毒的檢測受到病毒的提取效率、RNA的提取效果和樣品對PCR反應(yīng)體系的抑制等因素的影響，而過程控制病毒的引入，可以有效的監(jiān)測樣品中病毒提取、RNA提取和純化和RNA反應(yīng)提取的有效性，保證結(jié)果的可靠性。目前常用的的過程控制病毒有MS2噬菌體、門果病毒和鼠諾如病毒。其中MS2噬菌體的優(yōu)勢為：1）國際通用過程控制病毒，在歐盟、美國廣泛應(yīng)用，大量文獻(xiàn)應(yīng)用MS2噬菌體做為過程控制病毒；2）結(jié)構(gòu)和病毒相似，性質(zhì)類似，更準(zhǔn)確的標(biāo)定；3）與其他病毒RNA無交叉；4）食品中不含有該噬菌體，無背景；5）可以實現(xiàn)細(xì)胞外擴(kuò)增，實現(xiàn)精準(zhǔn)定量；6）可同時標(biāo)定回收率和擴(kuò)增效率。

 

2.2 RNA提取和純化

可以按照標(biāo)準(zhǔn)里手工提取，也可以使用商品化的病毒RNA提取純化試劑盒。如選用手工提取則需要按照所需對復(fù)溶體積進(jìn)行調(diào)整。如使用商品化的試劑盒則按照試劑盒操作說明操作。建議使用商品化病毒RNA提取試劑盒。RNA提取液應(yīng)立即進(jìn)行檢測，如需長期保存建議-80℃保存。

 

2.3 實時熒光RT-PCR反應(yīng)

可以按照GB 4789.42-2016中的引物探針及反應(yīng)體系進(jìn)行配置，也可以使用商品化諾如病毒核酸檢測試劑盒。應(yīng)提起注意的是：1）逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)溫度取決于反應(yīng)體系中相應(yīng)酶的溫度，應(yīng)按照說明使用；2）反應(yīng)體系的體積也應(yīng)按照試劑盒操作使用；3）外加擴(kuò)增對照的使用，常用外加擴(kuò)增對照有諾如病毒GI/GII質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)錄RNA、諾如病毒GⅠ/GⅡ病毒粒子提取病毒RNA、門果病毒RNA、MNV-1病毒RNA、MS2噬菌體RNA。推薦使用MS2噬菌體RNA。

 

 

3 諾如病毒檢測過程—以牡蠣為例

牡蠣生長在港灣，易受流入海水的淡水污染養(yǎng)殖牡蠣的池塘與排污渠道相連，易受污水的污染，尤其是受到糞便排出物的污染。 牡蠣為濾食性動物，通過濾食水中微囊藻以獲取食物的同時，消化道粘膜上粘多糖分子的硫酸根可與水中的諾如病毒結(jié)合并將病毒轉(zhuǎn)入消化道積聚起來，成為病毒粒子的被動攜帶者。牡蠣消化道內(nèi)諾如病毒粒子的數(shù)量可以高于周圍水域幾十甚至上千倍。

 

3.1 病毒提取

稱取2g牡蠣腺體組織剪碎或者勻漿，每份樣品中加入10ul MS2過程控制，加入2.0mL蛋白酶K溶液，混勻。2）恒溫?fù)u床37℃，震蕩60min。60℃，水浴15min。3）3000r/min，離心5min，轉(zhuǎn)移上清，測定并記錄上清的mL數(shù)（V1）。

 

3.2 RNA提取

選用病毒 RNA 提取試劑盒，提取樣品中的總RNA，需記錄上樣體積V2和洗脫體積V3。

 

3.3 MS2過程控制

取20 μL MS2 噬菌體，于95 ℃加熱5 min 后在冰上冷卻。按照1:9 的比例進(jìn)行梯度稀釋（做3 個稀釋梯度），一共4 個濃度，用于制作過程控制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

3.4反應(yīng)體系配置

（1）將試劑短暫離心，按照樣本數(shù)量準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)液（包括空白對照、陰性對照、過程控制和陽性對照），混勻后短暫離心，并分裝，每管20 μL。如下圖：

（2）設(shè)定樣本孔、樣本稀釋孔、過程控制孔、陽性對照孔、陰性對照孔、空白對照孔，布局可參考下圖：

 

 

 

3.5 儀器設(shè)置

設(shè)定樣本孔、 樣本稀釋液孔、 標(biāo)準(zhǔn)品孔(MS2)、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液孔(3個梯度MS2)、 陽性對照孔、 陰性對照孔、 空白對照孔。通道選擇： GI 檢測熒光通道為 HEX， GII 檢測熒光通道為 FAM， MS2檢測通道為 Cy5。

 

 

3.6 上機(jī)檢測

向每個諾如病毒檢測 PCR 管中分別加入 5μL 模板（ 包括 RNA 提取物及其 10 倍稀釋液、 MS2 標(biāo)準(zhǔn)品及其稀釋液、 陽性對照、 陰性對照、 空白對照）；

向空白對照管中加入5 μL 空白對照；

向陰性對照管中加入5 μL 陰性對照；

向陽性對照管中分別加入5 μL 陽性對照；

向過程控制管中分別加入5 μL 過程控制及其梯度稀釋；

向樣本管中分別加入5 μL 樣本提取液及其10 倍稀釋；

蓋好 PCR 管管蓋， 在離心機(jī)上瞬離一下， 然后將 PCR 管放入 PCR 儀中并運行設(shè)置程序。

 

3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

MS2 的標(biāo)準(zhǔn)品效價約為 5.0x1010pfu/mL， 未稀釋 RT-PCR 時的 Ct 值約為19.80±0.80。

以未稀釋和梯度稀釋過程控制的濃度lg 值為X 軸，以其Ct 值為Y 軸，建立過程控制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.98，斜率在-3.50~-3.10 之間。

 

3.8 檢測有效性判定

過程控制、陽性對照沒有典型的擴(kuò)增曲線或者陰性對照、空白對照有擴(kuò)增曲線→重新實驗； 

提取的RNA樣本沒有MS2擴(kuò)增曲線→重新實驗；

 標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＜0.98或者斜率不在-3.50~-3.10之間→重新實驗；

 提取效率＜1%→重新實驗；

樣本稀釋液與樣本Ct值之差＜1.3→Ct值要從樣本的10倍稀釋管中來判斷。

 

3.9 結(jié)果判定

HEX通道檢測諾如病毒GI型，F(xiàn)AM通道檢測諾如病毒GII型

在檢測有效的情況下， HEX 通道為諾如病毒 GI 檢測結(jié)果，F(xiàn)AM 通道為諾如病毒 GII 檢測結(jié)果；

Ct≤35， 諾如病毒陽性；

35＜Ct＜40，建議樣本重做，重做結(jié)果Ct ≥ 40，諾如病毒GI 陰性，否則為諾如病毒GI 陽性；

Ct≥40， 諾如病毒陰性。

 

4 Real Time RT- PCR 技術(shù)介紹

real-time RT-PCR中間的“RT”是 reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄），整個意思就是利用 mRNA 或 總RNA 為模板的實時逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（quantitative Real-time RT-PCR）。real time RT-PCR指的是 qPCR+RT-PCR的組合，是說將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再作為模板進(jìn)行實時熒光PCR分析，因為RT-PCR是可以定性的，但不能進(jìn)行定量檢測的。real-time RT-PCR（RT-qPCR） 就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的反轉(zhuǎn)錄PCR：先從 RNA 反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR進(jìn)行定量分析（qPCR）。

實時熒光PCR與普通RT-PCR的區(qū)別：1）實時檢測（在對數(shù)擴(kuò)增期）而不是終點檢測；2）靈敏度高，需要樣品少；3）特異性高，精確定量； 4）在密閉的反應(yīng)管中進(jìn)行，無需接觸EB等有害物質(zhì)，減少對環(huán)境中氣溶膠的污染，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。