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透射電子顯微鏡簡介

眼睛是人類認(rèn)識客觀世界的第一架“光學(xué)儀器”，但它的能力卻是有限的，通常認(rèn)為人眼睛的分辨率為0.1 mm。17世紀(jì)初，光學(xué)顯微鏡出現(xiàn)，可以把細(xì)小的物體放大到千倍以上，分辨率比人眼睛提高了500 倍以上，這也是人類認(rèn)識物質(zhì)世界的一次巨大突破。20世紀(jì)70年代，透射式電子顯微鏡的分辨率約為0.3納米(人眼的分辨本領(lǐng)約為0.1毫米)?，F(xiàn)在電子顯微鏡最大放大倍率超過300萬倍，而光學(xué)顯微鏡的最大放大倍率約為2000倍，所以通過電子顯微鏡就能直接觀察到某些重金屬的原子和晶體中排列整齊的原子點(diǎn)陣。

透射電鏡，即透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，簡稱TEM），通常稱作電子顯微鏡或電鏡（EM），是使用最為廣泛的一類電鏡。透射電鏡是一種高分辨率、高放大倍數(shù)的顯微鏡，是材料科學(xué)研究的重要手段，能提供極微細(xì)材料的組織結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分等方面的信息。透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數(shù)為幾萬～幾十萬倍。

電子顯微鏡是一種高精密度的電子光學(xué)儀器，它具有較高分辨本領(lǐng)和放大倍數(shù)，是觀察和研究物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的重要工具。電子顯微鏡是根據(jù)電子光學(xué)原理，用電子束和電子透鏡代替光束和光學(xué)透鏡，使物質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)在非常高的放大倍數(shù)下成像的儀器。電子顯微鏡的分辨能力以它所能分辨的相鄰兩點(diǎn)的最小間距來表示。

透射電子顯微鏡的應(yīng)用

透射電鏡具有分辨率高、可與能譜儀等其他技術(shù)聯(lián)用的優(yōu)點(diǎn)，在材料學(xué)、物理、化學(xué)和生物學(xué)等多個領(lǐng)域有著廣泛地應(yīng)用。材料的微觀結(jié)構(gòu)對材料的力學(xué)、光學(xué)、電學(xué)等物理化學(xué)性質(zhì)起著決定性作用。透射電鏡作為材料表征的重要手段，不僅可以用衍射模式來研究晶體的結(jié)構(gòu)，還可以在成像模式下得到實(shí)空間的高分辨像，即對材料中的原子進(jìn)行直接成像，直接觀察材料的微觀結(jié)構(gòu)。電子顯微技術(shù)對于新材料的發(fā)現(xiàn)也起到了巨大的推動作用，D.Shechtman 借助透射電鏡發(fā)現(xiàn)了準(zhǔn)晶，重新定義了晶體，豐富了材料學(xué)、晶體學(xué)、凝聚態(tài)物理學(xué)的內(nèi)涵，D.Shechtman 也因此獲得了2011年諾貝爾化學(xué)獎。

在物理學(xué)領(lǐng)域中，電子全息術(shù)能夠同時提供電子波的振幅和相位信息，從而使這種先進(jìn)的顯微分析方法在磁場和電場分布等與相位密切相關(guān)的研究上得到廣泛應(yīng)用。目前，電子全息已經(jīng)應(yīng)用在測量半導(dǎo)體多層薄膜結(jié)構(gòu)器件的電場分布、磁性材料內(nèi)部的磁疇分布等方面。中國科學(xué)院物理研究所的張喆和朱濤等利用高分辨電子顯微術(shù)和電子全息方法研究了Co 基磁性隧道結(jié)退火熱處理前后的微觀結(jié)構(gòu)和相應(yīng)勢壘層結(jié)構(gòu)的變化，研究結(jié)果表明，退火處理可以明顯地改善勢壘層和頂電極、底電極之間的界面質(zhì)量，改進(jìn)勢壘本身的結(jié)構(gòu)。

在化學(xué)領(lǐng)域，原位透射電鏡因其超高的空間分辨率為原位觀察氣相、液相化學(xué)反應(yīng)提供了一種重要的方法。利用原位透射電子顯微鏡進(jìn)一步理解化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理和納米材料的轉(zhuǎn)變過程，以期望從化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)理解、調(diào)控和設(shè)計材料的合成。目前，原位電子顯微技術(shù)已在材料合成、化學(xué)催化、能源應(yīng)用和生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。透射電鏡可以在極高的放大倍數(shù)下直接觀察納米顆粒的形貌和結(jié)構(gòu)，是納米材料最常用的表征手段之一。天津大學(xué)的杜希文和美國Brookhaven 國家實(shí)驗(yàn)室的Houlin L.xin 等用原位透射電鏡觀察了Co Ni雙金屬納米粒子在氧化過程中形貌的變化，充分混合的Co、Ni 合金粒子經(jīng)過氧化后，Co 和Ni 發(fā)生了空間上的部分分離，并在理論上對該現(xiàn)象進(jìn)行了解釋。

在生物學(xué)領(lǐng)域，X 射線晶體學(xué)技術(shù)和核磁共振常被用來研究生物大分子的結(jié)構(gòu)，已經(jīng)能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)的位置精度確定到0.2 nm，但是其各有局限。X 射線晶體學(xué)技術(shù)基于蛋白質(zhì)晶體，研究的常常是分子的基態(tài)結(jié)構(gòu)，而對解析分子的激發(fā)態(tài)和過渡態(tài)無能為力。生物大分子在體內(nèi)常常發(fā)生相互作用并形成復(fù)合物而發(fā)揮作用，這些復(fù)合物的結(jié)晶化非常困難。核磁共振雖然能夠獲得分子在溶液中的結(jié)構(gòu)并且能夠研究分子的動態(tài)變化，但主要適合用來研究分子量較小的生物大分子。近年來冷凍電鏡技術(shù)突破了冷凍成像和圖像處理瓶頸，發(fā)展成為當(dāng)今結(jié)構(gòu)生物學(xué)廣泛應(yīng)用的新興技術(shù)。它可以以快速、高效、簡易、高分辨率解析高度復(fù)雜的超大生物分子結(jié)構(gòu)，在很大程度上超越了傳統(tǒng)的X 射線晶體學(xué)技術(shù)。清華大學(xué)施一公研究組利用酵母細(xì)胞內(nèi)源性蛋白提取獲得了性質(zhì)良好的樣品，利用單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)，解析了酵母剪接體近原子水平的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，闡述了剪接體對信使RNA前體執(zhí)行剪接的工作機(jī)理。

透射電子顯微鏡的發(fā)展方向

目前，透射電子顯微術(shù)有幾個重要的發(fā)展方向。第一，分辨率的提升。分辨率一直是透射電鏡發(fā)展的目標(biāo)和方向，發(fā)展新一代單色器和球差校正器，進(jìn)一步提高透射電鏡的能量分辨率和空間分辨率，尤其是對低壓電鏡。第二，發(fā)展原位透射電鏡技術(shù)。原位透射電鏡在材料合成、化學(xué)催化、生命科學(xué)和能源材料領(lǐng)域有著重要應(yīng)用，可以通過在原子尺度下實(shí)時觀察和控制氣相反應(yīng)和液相反應(yīng)的進(jìn)行，從而研究反應(yīng)的本質(zhì)機(jī)理等科學(xué)問題。第三，更加廣泛的應(yīng)用在生物大分子結(jié)構(gòu)研究中。冷凍電鏡在生物大分子結(jié)構(gòu)研究中的廣泛應(yīng)用，將推動冷凍電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展。冷凍電鏡在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視，成為連接生物大分子和細(xì)胞的紐帶和橋梁。

透射電子顯微鏡的制樣流程

目前只有兩種方法： 

一．負(fù)染色技術(shù) 

負(fù)染色技術(shù)簡單快速，可以顯示生物大分子、細(xì)菌、分離的細(xì)胞器以及蛋白晶體等樣品的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小以及表面結(jié)構(gòu)的特征。尤其在病毒學(xué)中，負(fù)染色技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用。 

樣品要求：

①樣品懸液的純度不要求很純，但是如果雜質(zhì)太多，如大量的細(xì)胞碎片，培養(yǎng)基殘?jiān)?，糖類以及各種鹽類結(jié)晶的存在都會干擾染色反應(yīng)和電鏡的觀察。尤其是不能有過多的糖類，因?yàn)樵陔娮邮霓Z擊下，糖類容易碳化而有礙觀察，因此樣品要適當(dāng)提純。

②樣品懸液的濃度要適中，太稀在電鏡下很難找到樣品，太濃樣品堆積影響觀察。 

操作流程：吸取樣品懸液滴到有膜的銅網(wǎng)上，靜置數(shù)分鐘，然后用濾紙吸去多余的液體，滴上負(fù)染色液，染色1～2min后濾紙吸去負(fù)染色液，待干后用于電鏡觀察。 

二、超薄切片技術(shù) 

超薄切片技術(shù)是為透射電鏡觀察提供薄樣品的專門技術(shù)，是生物學(xué)中研究細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)最常用的技術(shù)。廣泛應(yīng)用于生物體的各種細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察。一般厚度在10～100nm的切片稱為超薄切片，制作這種切片的技術(shù)叫做超薄切片技術(shù)。超薄切片制作的過程包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個環(huán)節(jié)，和一般光學(xué)顯微鏡的石蠟切片過程相似。但是，超薄切片切片過程更為細(xì)致與復(fù)雜，要求更嚴(yán)格，而且所用的試劑比較昂貴、配制復(fù)雜、強(qiáng)致癌。具體操作步驟、注意事項(xiàng)如下： 

1． 取材和前固定：快速的切取大小為0.5～1.0mm3的樣品塊，一分鐘內(nèi)把組織（樣品）塊浸入2.5％戊二醛（進(jìn)口品質(zhì)）溶液（取樣前來平臺領(lǐng)取），每個離心管內(nèi)裝20個以上的樣品塊，作為一個樣送到平臺。要求：

①取材前一定要和工作人員取得電話聯(lián)系！

②取材選擇部位要準(zhǔn)確可靠，確保每塊材料都是要觀察的部位。

③所有植物樣品一定要抽真空，能夠沉底的樣品也抽真空15mins，不能沉底的樣品一定要抽真空致沉底！

④細(xì)菌、散在細(xì)胞等不能成塊的樣品，加戊二醛固定液，離心沉淀后送到平臺，由平臺工作人員處理。

⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。

2． 漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2沖洗3次，每次15mins。

3． 后固定：加入1％鋨酸處理到樣品變黑。植物樣品一般處理2.5hours，真菌、細(xì)菌一般處理2hours，動物樣品處理1hours。注意事項(xiàng)：①鋨酸劇毒物質(zhì)，易揮發(fā)，操作時要在毒品柜中謹(jǐn)慎使用。②鋨酸比較昂貴，需特別節(jié)約使用。 

4． 漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2沖洗3次，每次15mins。 

5． 脫水：室溫下，丙酮30％－50％－70％－80％－90％每級作用30mins，純丙酮在作用3次，每次作用30mins。

6． 滲透：其目的是使包埋劑逐步滲入組織細(xì)胞內(nèi)。植物樣品需要的滲透梯度多、滲透時間長。其他樣品可以適當(dāng)減少或縮短滲透梯度和時間。以二葉齡水稻葉片為例，其滲透流程如下：無水丙酮/包埋劑＝5：1作用12hours→無水丙酮/包埋劑＝3：1作用12hours→無水丙酮/包埋劑＝1：1作用12hours→無水丙酮/包埋劑＝1：3作用12hours→無水丙酮/包埋劑＝1：5作用12hours→純包埋劑作用45℃作用12hours。注意事項(xiàng)：包埋劑為強(qiáng)致癌劑，特別要注意規(guī)范操作！ 

7． 包埋：用牙簽將滲透好的樣品挑到包埋板中，45℃聚合12hours，60℃聚合36～48hours。 

8． 超薄切片：超薄切片的切片面積最大不能超過0.5mm×0.3mm，比較難切的植物樣品要求切片面積更小。超薄切片是在超薄切片機(jī)上進(jìn)行，但是切出比較理想的超薄切片，卻是一件不容易的工作。做好需要有滲透、包埋好的包埋塊，還要有好的切刀以及操作者的熟練技術(shù)等。超薄切片前期需要準(zhǔn)備載網(wǎng)和支持膜、修塊、制刀等，前期準(zhǔn)備工作至少需要半天時間。超薄切片是極其精細(xì)、耗費(fèi)眼力的工作，需要靜下心來慢慢操作，切好一個樣品至少需要1小時。

9． 正染色：由于生物樣品主要由碳、氫、氧、氮等輕元素組成。這些元素原子對電子的散射能力很弱，相互之間的差別也很小。尤其生物超薄切片被樹脂所包埋，這些包埋樹脂對電子的散射能力與樣品本身差別很小。因此生物樣品超薄切片觀察時像的反差極弱。為了提高圖像的反差，要對超薄切片進(jìn)行電子染色。這里所謂電子染色是根本不同于光學(xué)顯微鏡的染色，它是利用重金屬鹽（如鉛鹽、鈾鹽等）與細(xì)胞的某些成分或結(jié)構(gòu)結(jié)合，由于重金屬對電子散射能力很強(qiáng)，使那些與其結(jié)合的結(jié)構(gòu)或成份對電子散射能力增強(qiáng)，從而達(dá)到提高樣品本身反差的。目前最常用的染色劑是醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液。操作流程是：超薄切片先檸檬酸鉛染色10分鐘，去二氧化碳的雙蒸水清洗3次，再用醋酸鈾染色30分鐘，雙蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射電鏡觀察。注意事項(xiàng)：

①醋酸鈾具有放射性，使用時要特別注意。

②檸檬酸鉛染液極易和空氣中的二氧化碳反應(yīng)形成不溶解的黑色顆粒，污染切片。檸檬酸鉛染液一定要現(xiàn)用相配，所用的雙蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。③由于染色不可控制因素較多，產(chǎn)生污染的幾率有40％，所以每個樣品的切片一定要留出銅網(wǎng)作備份。