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樣品的溫度、觀測核的頻率和樣品中自旋核的數(shù)目都會影響檢測信號的強度。將樣品的濃度盡可能最大化并降低樣品的溫度方面來改進檢測靈敏度的方式不是在任何情況之下都可行的。增加溶質(zhì)的量和降低溶液溫度會增加溶液粘度，從而降低譜圖的分辨率，因此粘度引起的譜峰增寬實際上降低了信噪比。

 

配制高質(zhì)量的樣品溶液是得到理想核磁數(shù)據(jù)的前提條件。下面介紹配置高質(zhì)量樣品的一些基本原則。

 

1核磁樣品管的選擇

 

盡可能選擇經(jīng)濟承受范圍以內(nèi)的最高質(zhì)量核磁樣品管。樣品管的直徑與核磁核磁探頭的線圈直徑相匹配。除非沒有其他的選擇，不要把5mm的樣品管放在10mm的探頭里面。在任何情況下，絕對不能使用比探頭線圈直徑大的樣品管。對于大多數(shù)的有機樣品，wilmad 527-pp-7(國外報價10美元以內(nèi))或者同等質(zhì)量的樣品管就能夠滿足需要。價格便宜的樣品管管壁厚度不一，這種不均勻性使得樣品在勻場過程中很難甚至不可能達(dá)到很好的狀態(tài)。同軸性、曲面、橫截面的不均勻性都限制了數(shù)據(jù)的質(zhì)量。想辦法在核磁管上節(jié)約成本的人應(yīng)當(dāng)了解一下公式（1），其中t為時間，$為花費，通過公式計算，我們可以選擇在核磁管上多花費$10或者花一個小時時間來勻場還可能得不到分辨很好的圖譜。另外，核磁管可以多次使用，高質(zhì)量核磁管的額外花費在多年的使用過程很容易就會回報回來。

 

2樣品的純度

 

樣品純度越高越好。核磁實驗希望樣品有高的溶解度，但是樣品的純度高更好。如5mM高純度產(chǎn)物比20mM摻雜有其他異構(gòu)體或者中間反應(yīng)產(chǎn)物更好。為了采集到的13C信號更強，可以在做樣品提純之前先測試一維的碳譜。根據(jù)氫碳－HMQC/HSQC和HMBC圖譜結(jié)果能幫助區(qū)分出混合物中1D譜圖里的假峰。在機時緊張的情況下，很難保障提純后的樣品能夠得到信噪比足夠高的13C譜。也就是說，提純后低濃度的樣品花24個小時采集的一維碳譜有可能在我們希望能夠觀測到季碳化學(xué)位移的范圍內(nèi)只看到噪聲。掃描4天后雖然能夠加倍信噪比，但是在多用戶使用的條件下也是不可行的。因此如果我們只有少量的產(chǎn)品，可以通過二維技術(shù)，避免重復(fù)合成、分離、提純和樣品的準(zhǔn)備，在不用掃描一維13C譜的情況下，還是能夠完全的指認(rèn)我們分子的1H和13C譜峰。

 

3氘代溶劑的選擇

 

使用高質(zhì)量的氘代試劑。盡可能使用一次性的0.5到0.6毫升的小瓶試劑，而不是用容量為50或者100g的大包裝試劑。氘代氯仿保存時間超過6個月會降解產(chǎn)生酸性，因此會交換溶質(zhì)分子中的不穩(wěn)定氫。如果溶質(zhì)分子包含有低的pKa的氫原子或者被酸催化會被降解時，必須要特別注意這一點。

 

4核磁管的清洗（大家亦可查看上期“15個NMR常見問題”中核磁管清洗經(jīng)典操作）

 

當(dāng)使用樣品管的時候，即使是新樣品管，也要進行徹底的清洗。如果清洗核磁管不當(dāng)，會檢測到核磁管殘留的溶劑信號。一般情況下把樣品管浸泡在鐘酒精浴中30秒能夠解決此問題。注意，當(dāng)進行此步驟的時候，需要帶上手套、實驗服或者圍裙、安全口罩或者面罩。

 

有時候，使用正確的方式清洗核磁管也會不可避免的引起物理磨損。在這種情況下，我們就要輕輕的擦洗核磁管的內(nèi)壁和外壁。可以用管刷來清潔5mm樣品管，但是必須非常小心以免管刷尾部暴露的金屬刮壞核磁管的內(nèi)壁。

 

另外也可以使用核磁樣品管清洗器，這種裝置可以在Wilmad核磁管代理和青島騰龍微波公司處買到。如果可能，使用色譜或者光譜純度水或者丙酮用于最后的沖洗。最好的沖洗最好不要使用DMSO，除非接下來需要重新使用DMSO溶解樣品。這是因為DMSO蒸氣壓力低而造成其揮發(fā)慢。注意：在使用DMSO時一定要戴手套。如果DMSO溶液接觸到我們的皮膚，DMSO就會將溶質(zhì)透過皮膚直接導(dǎo)入到我們的體內(nèi)血液循環(huán)中去。

 

5核磁管的干燥

 

烘干價格昂貴的核磁管時，盡量把核磁管平放在廚房用紙或者干凈的織物上面。不要把核磁核磁管豎直放在容器或者燒瓶中存放，不要把樣品管放在干燥箱中超過一分鐘。價格昂貴的核磁核磁管同心性和弧度非常高，壁厚和玻璃組成成分非常均勻。管壁越厚，玻璃管在平面上滾動越快。如果將核磁管直立在干燥箱的容器內(nèi)，地心引力會將核磁管彎曲，改變本來的弧度。如果將核磁管平放太長時間，它們也會形成一段橢圓形的部分，因而同心性會變差。而薄的管壁比較容易破損。

 

另外，核磁管可以用核磁管檢測器來檢查同心性和弧度。核磁管檢測器可以從Wilmad或者其他廠商買到。

 

6樣品混合

 

如果樣品有限，并已經(jīng)樣品溶解到溶劑中，必須確認(rèn)溶液完全混合。但是，在混合樣品時必須很小心，因為標(biāo)準(zhǔn)高密度聚乙烯材質(zhì)的核磁核磁管帽子可被常用的氘代核磁溶劑溶解（至少染色劑會被溶解）。用振蕩器可以實現(xiàn)有效混合，但是也有例外。核磁核磁經(jīng)驗豐富的人經(jīng)常用一只手輕輕的握住核磁管，用手指拍打來加速混合和溶解（對薄壁核磁管一定要特別小心，例如wilmad 535-pp或者更高質(zhì)量）。有時可用細(xì)長巴斯德吸液管重復(fù)吸走再引入來加速混合。重水樣品在混合過程中容易產(chǎn)生氣泡，因此必須小心不要太用力的混合。

 

7樣品的體積

 

配制溶液的體積會影響到勻場速度。在5mm直徑的核磁核磁管里，體積為0.6-0.7ml的溶液最適宜的。

 

每一臺核磁核磁譜儀都配有一個高度量筒來準(zhǔn)確標(biāo)定核磁管相對于探頭檢測線圈的位置。如圖1所示，當(dāng)轉(zhuǎn)子-樣品管裝好并放進磁體之后核磁核磁管的樣品將處于探頭的檢測器區(qū)域，（檢測器在電阻器-電感線圈-電容器回路中的電感線圈）。在把核磁管放進轉(zhuǎn)子之前，需要小心翼翼的擦拭核磁管（指紋會有信號并妨礙平穩(wěn)轉(zhuǎn)動）。利用高度量筒將核磁管在轉(zhuǎn)子里定位，一旦樣品管-轉(zhuǎn)子在空氣的幫助下放入磁體內(nèi)，溶液的上表面（溶液凹面）和下表面（管子底部）到檢測區(qū)域的中心是等距的。

 

千萬不要讓樣品管超出轉(zhuǎn)子中樣品深度的最大值，這樣將導(dǎo)致樣品管放入的時候損壞核磁管或探頭上的玻璃保護套。如果樣品管的溶液過高，不能把溶液的中心對準(zhǔn)檢測區(qū)域的中心。此時，把轉(zhuǎn)子中的樣品管推到最低深度，此時凹面到檢測中心的距離長于核磁管底部到檢測中心的距離。

 

8樣品濃度

 

理想情況下，我們嘗試使用一個樣品濃度的平衡。如果我們的樣品太稀，采集一個簡單的一維譜圖可能會花掉幾個小時的時間。如果樣品太濃，信號峰會因高濃度引起的粘度過高，分子轉(zhuǎn)動速度變慢而增寬。分子轉(zhuǎn)動速度慢只會部分平均偶極和化學(xué)位移張量，不能實現(xiàn)各個方向的平均。只有各個取向的平均才能觀測到窄的共振峰。

 

a、溶質(zhì)過量的情況

當(dāng)樣品充裕的時候，配制溶液應(yīng)當(dāng)確保均勻。首先必須避免固體存在于核磁管中，一個例外情況是干的分子篩（或者干燥劑）在核磁樣品管的底部，遠(yuǎn)離檢測區(qū)域。如果想要配制飽和溶液又不擔(dān)心粘度高引起核磁核磁譜峰增寬，可加入過量溶質(zhì)充分混合之后再過濾。

 

沒有過濾的溶液也可以進行核磁檢測，但是這種實驗的結(jié)果一般不是很理想，因為這會丟失掉很多有用的細(xì)節(jié)信息，同時會引起核磁譜峰增寬。固體和液體的磁化率（讓磁場線透過材料的能力）有很大差別，因此盡量避免能夠引起譜線增寬的因素。溶液的不均一性將導(dǎo)致磁場不均勻，這種不均勻性很難通過勻場線圈進行有效的補償。新手描述溶液中的固體存在方式為漂浮（在溶液頂部的固體）或者沉淀（在溶液底部的樣品）或者懸?。ㄔ谌芤褐胁康墓腆w）。在這三種情況中，懸浮引起的問題更多，因為這些固體會不斷的進出檢測區(qū)域。每個沒有溶解的溶質(zhì)顆粒通過檢測區(qū)域時都會有磁場均勻性的畸變。

 

溶液在放入核磁樣品管之前首先要過濾固體顆粒。當(dāng)使用傳統(tǒng)核磁樣品管的時候，樣品的溫度必須一直保持在溶劑的沸點以下，尤其是當(dāng)使用腐蝕性的溶劑如三氟醚乙醇（TFE）和三氟乙酸（TFA）時更要如此。因為加熱樣品會給核磁樣品管造成額外的壓力，樣品管的帽子可能會崩開，樣品管內(nèi)的溶液會噴出濺到磁體上部的腔體上，然后滴落到核磁探頭內(nèi)，因而對儀器造成很大的損害。在核磁管帽周圍包裹聚氯乙烯絕緣帶可以防止樣品在加熱的過程中帽子被彈出，但是更可行的方法是使用特殊的核磁管，例如J.Young核磁管。

 

b、溶質(zhì)有限的情況

當(dāng)溶質(zhì)量有限且溶解度很高時，可以嘗試減少溶液總體積來增加濃度。但是溶液體積太少會引起譜峰增寬，從而降低了信噪比。這種譜峰變寬是由于檢測區(qū)域附近磁場的不均勻造成的，也就是，減少溶液的體積來增加濃度經(jīng)常會利大于弊。

 

如果樣品的量雖然少，但是稀釋之后可以在儀器時間允許的情況下完成實驗，此時，我們可以借助于使用磁化塞子，shigemi管，甚至特殊的探頭（價格昂貴的可用特殊核磁管），例如布魯克80微升樣品容量的微量探頭或者瓦里安40微升樣品容量的nano探頭。在400MHz或者500MHz 核磁譜儀上，經(jīng)驗證明掃描濃度低于2mM樣品的2D譜圖是有問題的。掃描濃度低于5mM樣品的一維碳譜也是有問題的。在200 MHz或者300MHz 核磁譜儀上，需要的樣品濃度大約是上述要求的兩倍。

 

9最優(yōu)化的溶質(zhì)濃度

 

一般而言，獲取優(yōu)質(zhì)核磁圖譜的樣品濃度在20-50mM范圍之間。溶液粘度引起的偶極作用或者化學(xué)位移各向異性引起的譜線增寬的臨界點會依據(jù)溶質(zhì)的量、溶劑、溫度和核磁操作者判斷而改變。

 

樣品濃度對于核磁測試非常重要。假設(shè)濃度為20mM的樣品，花費30秒鐘時間采集氫譜（掃描4次），其中非耦合甲基峰的信噪比為100:1。同一樣品濃度為1.4mM時，該甲基峰的信噪比是多少呢？

 

信號強度Si直接正比于掃描次數(shù)n和樣品的濃度Ci，但是噪聲部分被抵消，只有掃描次數(shù)的平方根。因而信噪比的增長為掃描次數(shù)的二分之一次方。

 

如果20mM樣品采樣30秒的信噪比為100:1，1.4mM樣品相同條件下信噪比則為1.4/20×100:1或者7:1。

 

1.4mM樣品要得到20mM樣品（30秒）的信噪比，必須增加兩個濃度比例平方的采樣時間，即使用核磁儀器時間（98分鐘）得到同樣的信噪比。

 

10避免樣品的降解

 

在前面提到，使用一次性溶劑溶解樣品，盡可能阻止樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)包括不穩(wěn)定的質(zhì)子交換。使用有機溶劑的時候，盡可能保持樣品無水，如在5mm樣品管的底部放入分子篩，保持分子篩邊緣處于樣品的檢測區(qū)域以外。

 

盡可能減少樣品暴露在氧氣和水蒸氣中的時間，方便的話在手套箱中準(zhǔn)備樣品。如果要保證核磁管內(nèi)的樣品處在惰性的環(huán)境中，可以先使用乳膠膜取代聚乙烯帽子密封我們的樣品管，然后使用插管透過乳膠膜將溶液倒入到樣品管中。但是乳膠膜隨著時間變長可滲透氧氣和水蒸氣。把另一個保護套套在核磁樣品管帽子上也會降低水蒸氣和氧氣進入引起的降解。要意識到樣品管賣家在銷售時不會清洗樣品管。