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1、如果基線噪音大或發(fā)生漂移(不穩(wěn))該怎樣處理。

基線噪音大或飄移一般與高背景本底電流有關(guān),而使背景電流變大的因素很多。下面例舉一些有可能

引發(fā)HPLC-ECD系統(tǒng)背景電流變大的因素。而除了大的背景電流外，還有別的因素可引起噪音。千萬記住,

下面例舉的因素僅是一部分可能的因素,而且電化學(xué)電池本身不會(huì)產(chǎn)生特別的背景電流。背景電流是因分析條件,系統(tǒng)性能,已使用電化學(xué)電池的時(shí)間長短和處理電化學(xué)電池方法的不同而產(chǎn)生。

 

引發(fā)高本底電流的一般因素：

水！HPLC-ECD系統(tǒng)中使用的水非常關(guān)鍵,要求每厘米的阻抗必須大于或等于 18 兆歐姆。因而建議水要進(jìn)一步的純化,通過一種被稱作洗水的過程。(參考ESA的技術(shù)說明"Water Polishing"文件目錄號(hào):70-1668)制備樣品或制作流動(dòng)相時(shí)使用了不純(或被污染)的化學(xué)藥品。樣品本身也許就是污染源。氧化鋁或在萃取時(shí)帶入的雜質(zhì)有可能會(huì)進(jìn)入HPLC系統(tǒng),從而污染色譜柱和電極。

 

流動(dòng)相中的電化學(xué)活性試劑(如:EDTA,TEA)。EDTA 是流動(dòng)相中經(jīng)常使用的一種試劑,用于螯合氧化的金屬離子,可降低本底電流。在電勢大于400毫伏時(shí),這種化合物(EDTA)具有很高的電化學(xué)活性。

 

如果工作電勢大于400毫伏,流動(dòng)相中就不能再使用EDTA而應(yīng)改用檸檬酸鹽來代替。TEA(三乙醇胺)是用來改善色譜峰的峰形。這種添加劑會(huì)含有電化學(xué)活性的雜質(zhì),在高電勢時(shí)這種雜質(zhì)會(huì)發(fā)生特別的氧化反應(yīng)。

 

因此要用最小量的TEA,典型的用量小于100 L/L或者對(duì)HPLC的色譜柱沒有活性的用量。

 

系統(tǒng)中的不銹鋼管可能被腐蝕。進(jìn)入系統(tǒng)的污染物或腐蝕處的臟物可能引起電化學(xué)電池受污染(淤塞)或本底電流變大。建議用不銹鋼管的用戶需定期鈍化系統(tǒng)管路或者換用PEEK管。PEEK管可直接從ESA購買。

 

如果脈沖阻尼器破裂,會(huì)有污染物進(jìn)入系統(tǒng),導(dǎo)致增大背景電流或壓力升高。

 

其它引起噪音或漂移的來源：

 

泵頭里有溶解于流動(dòng)相中氣體。泵壓的波動(dòng)通常與此有關(guān)。要確保流動(dòng)相被很好的脫氣。把泵停下來,等壓力下降后,然后把泵清洗(purge)30秒。流動(dòng)相在進(jìn)入系統(tǒng)使用前要脫氣 (詳情見下面的第6點(diǎn))

 

電化學(xué)電池中有溶解在流動(dòng)相中的氣體。要確保流動(dòng)相被充分脫氣。

 

帶清洗頭的電化學(xué)電池(如:5014B和 5041型電化學(xué)電池)在使用前可能沒有被很好的清洗。

 

安培法電化學(xué)電極(如:5040和5041型電化學(xué)電池)有可能在目標(biāo)電極處有小的泄漏。這主要是由安裝墊圈和電極失誤造成的。要牢記電極不能裝的太緊,同時(shí)要確保在裝配前所有部件必須完全是干燥的。

 

2、怎樣清洗電化學(xué)電極

參見技術(shù)說明"Prolonging Cell Performance"( 文件目錄號(hào):70-5017)。 它包含文字指導(dǎo)和技術(shù)

 

說明以保障電化學(xué)電極在最好的狀態(tài)下工作。

 

3、關(guān)閉系統(tǒng)時(shí)應(yīng)注意什么

關(guān)閉電化學(xué)電極的電勢。 用適當(dāng)?shù)南匆呵逑凑麄€(gè)系統(tǒng)(看下面的注意)。在電化學(xué)電極關(guān)閉和泵中的液體停止流動(dòng)時(shí),并非系統(tǒng)中的所有設(shè)備都必須得斷電。如果系統(tǒng)需長期存放建議斷掉所有設(shè)備的電源。

 

注意：對(duì)于HPLC-ECD系統(tǒng),設(shè)備的斷電程序因其需停機(jī)時(shí)間長短不一而不同。 下面是不同情況下合理的斷電程序

 

4、停機(jī)一晚上

非梯度系統(tǒng)--如果每天都在用此系統(tǒng),應(yīng)讓ECD系統(tǒng)一直開著。在此情況下,關(guān)掉電化學(xué)電極并讓流動(dòng)相以 0。1mL/min 的低流速循環(huán)(看下面的第4點(diǎn))。

 

梯度系統(tǒng)--對(duì)于梯度系統(tǒng)你不能再循環(huán)。而應(yīng)使A和B各以50%的量組成流動(dòng)相并使其總流速為0。025mL/min運(yùn)行系統(tǒng), 流動(dòng)相排到廢液中。

 

5、長期停機(jī)

徹底沖洗系統(tǒng)以洗掉鹽類物質(zhì)。建議使用的沖洗劑應(yīng)與實(shí)驗(yàn)時(shí)用的流動(dòng)相一致,只是不再含有緩沖劑或鹽類添加劑(如有機(jī)溶液和水)。注意!如果水或低濃度的有機(jī)溶液留在HPLC系統(tǒng)中時(shí)間很長有可能發(fā)生霉變并導(dǎo)致別的一些問題。對(duì)于硅填料的反向柱,水可能導(dǎo)致在線柱停留20到30分鐘不能被使用。在沖洗完鹽后,建議用柱子的生產(chǎn)廠家推薦的保存液再?zèng)_洗柱子,然后取出柱子并蓋好蓋子以防柱子變干。

 

如果存放時(shí)間超過幾個(gè)月,系統(tǒng)也應(yīng)封存好。

 

注意：大部分EC應(yīng)用的緩沖液鹽濃度在50-100mM。如果沒有流動(dòng),便有鹽在 HPLC系統(tǒng)中沉淀。

 

此沉淀能引起高的背壓和鬼峰及其它問題。 另外,沒有有機(jī)溶液(如:甲醇)的水性溶液易長菌。為防止長菌,ESA推薦使用有殺菌作用的試劑如MB(產(chǎn)品號(hào):70-1025)。

 

6、為什么要用孔徑為0.22 m的尼龍過濾器過濾流動(dòng)相和樣品

使用孔徑為0.22 m的過濾器有兩個(gè)主要原因。

 

第一個(gè)原因是要濾去流動(dòng)相中微粒以減少柱子的堵塞機(jī)會(huì)。第二個(gè)原因是庫侖電化學(xué)電池里的工作電極是由多孔石墨制成的。石墨孔徑大約為 0。2 m。為防止多孔石墨被微粒堵塞我們強(qiáng)力推薦使用孔徑為0。22 m 的過濾器。另外,過濾器要放在電化學(xué)電池的前面,為保護(hù)電化學(xué)電池一定要在線過濾。過濾器不是很貴,如果被堵住很容易被更換。

 

過濾器架子(產(chǎn)品號(hào): 70-0893)

石墨過濾膜(用于進(jìn)樣器前)(產(chǎn)品號(hào): 70-0898)

Peek過濾膜(用于進(jìn)樣器后)(產(chǎn)品號(hào):70-3824)

 

7、可以讓加電勢的狀態(tài)處于"On"一晚上嗎

只要 HPLC-ECD 系統(tǒng)中的流動(dòng)相(包含緩沖鹽)一直處于流動(dòng)狀態(tài)是可以的。一些用戶讓系統(tǒng)運(yùn)行,這取決于系統(tǒng)所需的平衡時(shí)間。若系統(tǒng)一直在運(yùn)行,那么在跑樣品前不需要平衡時(shí)間。然而,如果晚間泵出了故障,而電勢依然加在沒有流動(dòng)相流動(dòng)的電化學(xué)電極上,必然會(huì)損壞電化學(xué)電極。

 

請(qǐng)注意,如果對(duì)靈敏度的要求不高,如果所需平衡時(shí)間很短,在不運(yùn)行系統(tǒng)時(shí),最好關(guān)掉電化學(xué)電極或者使加在其上的電勢為 0 mV 。這樣通過減少電化學(xué)電極的工作時(shí)間和工作電流就可有效延長電化學(xué)電極的壽命,尤其是需要運(yùn)行在高電勢的情況下更應(yīng)如此。

 

8、當(dāng)我的基線以周期性的方式發(fā)生波動(dòng)時(shí)我該怎么做

當(dāng)基線以周期性的方式波動(dòng)時(shí)此基線可描繪成鋸齒狀。人們經(jīng)常會(huì)將噪音問題歸罪于電化學(xué)電池。而事實(shí)上 EC 電化學(xué)電池很少引起這種周期性的噪音。大多數(shù)情況是這種噪音是由泵的問題引起的。可以通過測量鋸齒波噪音的峰頭和峰谷(或兩峰頭) 間的距離來檢測這種噪音是否由泵引起。先測出峰間距(設(shè)為D1),再把液相流速降為原來的一半后再測出峰間距(設(shè)為D2),如果D2與D1接近兩倍關(guān)系,就可斷定是泵出了問題。引發(fā)泵產(chǎn)生這種噪音的因素有很多,下面是四個(gè)最易產(chǎn)生的因素：

 

1、止回閥堵塞---參考泵的使用手冊(cè)

 

2、泵頭中有氣體---灌注和清洗(purge)泵系統(tǒng),趕出其中的氣體

 

3、堵住了流動(dòng)相的入口或管子入口

 

4、泵的局限性*

 

*注意:由于在設(shè)計(jì)上不同泵產(chǎn)生無脈動(dòng)基線的能力不同,在進(jìn)行高靈敏度測量時(shí)一定要注意。電化學(xué)檢測器比紫外檢測器對(duì)噪音更敏感,故適用于紫外檢測器的無脈沖基線的泵并不一定能適用于具有高靈敏度的EC檢測器的應(yīng)用。為盡量減小基線波動(dòng)噪音,應(yīng)在泵后裝一個(gè)脈沖阻尼器,使基線更平穩(wěn)。

 

小心！在裝脈沖阻尼器之前一定要先詢問泵的生產(chǎn)廠商。有些泵是不能裝脈沖阻尼器的。

 

9、PH值會(huì)對(duì)電化學(xué)電極的響應(yīng)有什么影響

在大多數(shù)情況下,低pH值(酸性環(huán)境)將能有效阻止有些分析物質(zhì)被氧化。在低pH值環(huán)境,測量時(shí)物質(zhì)氧化所需的電勢會(huì)比中性或堿性環(huán)境高。反過來也是對(duì)的,高的 pH 值或(堿性環(huán)境)將有利于分析物質(zhì)的氧化。

 

注意：在大多數(shù)情況下低 pH 值環(huán)境是用來防止分析物質(zhì)(如:兒茶酚胺)自氧化。千萬記住,選擇不同的pH值將會(huì)影響化學(xué)分離,尤其是用色譜柱洗脫時(shí)的順序。一般來講不要太注重pH值對(duì)電極較高響應(yīng)的影響,而應(yīng)保證在自氧化最小的情況使被分析物質(zhì)得到有效分離。建立伏安曲線(CV 曲線)將有助于優(yōu)化分析物質(zhì)的響應(yīng)。本文檔的#8問題包含有關(guān)伏安曲線的信息。

 

10、我怎樣確定能產(chǎn)生最大響應(yīng)的最佳電勢

注意:這一過程假設(shè)色譜條件不會(huì)變(如:能達(dá)到物質(zhì)分離的一個(gè)穩(wěn)定的色譜方法)。這一過程也要求操作者擁有電化學(xué)理論知識(shí),懂得伏安曲線和操作Coulochem的基本知識(shí)?？蓞⒖糃oulochem II操作手冊(cè)中6。3,6。4a,和6。4b有關(guān)動(dòng)態(tài)伏安曲線的情況。

 

1、根據(jù)待分析物的情況設(shè)置HPLC-EC系統(tǒng)

 

2、打開電化學(xué)電極,給電極加電勢并要比文獻(xiàn)提供的待分析物所需電勢高出100 mV并讓它平衡

 

3、給沒有最優(yōu)化的通道加電勢到-200mV(記住每次只能優(yōu)化一個(gè)電極。設(shè)定電極的電勢為-200mV,基本可以消除正在該電極上氧化的物質(zhì))

 

4、做一次已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的進(jìn)樣。

注意：標(biāo)準(zhǔn)物應(yīng)是濃縮的(如:柱內(nèi)有10到50 ng),但不要在或靠近檢測器的檢測限進(jìn)行測定。 以你認(rèn)為能產(chǎn)生最大響應(yīng)的電勢跑一下此標(biāo)準(zhǔn)物將是非常重要的。

 

5、調(diào)整Coulochem上的增益或R值使你感興趣的峰落在你所選范圍的70~80%的區(qū)域內(nèi)

注意：調(diào)整增益使峰變大并易觀察但不能超出量程范圍。一旦增益或R值被設(shè)定,那么在整個(gè)過程中它們都得保持不變

對(duì)庫侖陣列電化學(xué)檢測器(CoulArray)來說,會(huì)自動(dòng)調(diào)節(jié)量程范圍,所以無需選擇。

 

6、接下來,加電勢到感興趣電極,并且電勢值要比前面進(jìn)樣時(shí)低50mV。讓基線穩(wěn)定下來并使檢測器自動(dòng)歸零。

 

7、一旦基線穩(wěn)定下來就可以進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)樣。確保色譜圖是完整的和可以接受的。記錄最終的高度和面積。

 

8、每次把電勢減少50mV重復(fù)上面的6和7直到看不見峰高和峰面積為止。

 

9、以峰高為Y 軸,所加電勢為X軸,分別畫出每種化合物的變化曲線。

 

10、在您的方法中,當(dāng)電勢增加時(shí),峰高和峰面積已達(dá)到最大,增加電勢不會(huì)再增加峰高和峰面積時(shí),應(yīng)選擇能達(dá)到最大面積時(shí)所需的最低電勢作為工作電勢(如:如果獲得最大峰響應(yīng)的電勢為450, 500 and550mV, 選擇400mV為工作電勢)。

 

11、對(duì)于我的電化學(xué)電極,pH操作范圍應(yīng)是多少

對(duì)于大部分情況,操作環(huán)境的pH范圍在 1-12都不會(huì)損壞電化學(xué)電池或其部件。但是,當(dāng)使用極端pH時(shí),一定要多加注意。要意識(shí)到pH呈堿性和大的背景電流同時(shí)作用將損壞電化學(xué)電池。還有,色譜柱對(duì)pH值的限制要求也要特別注意。一定要確保色譜柱適于你的pH環(huán)境,否則,不適宜的pH將使色譜柱的填料有可能進(jìn)入測量系統(tǒng)污染或損壞電化學(xué)電極。

 

12、多久更換一次過濾膜

理想的色譜條件下過濾膜是不需要更換的,然而在實(shí)際中因其被堵塞,是一定要定期更換的。更換頻率視流動(dòng)相和樣品中的顆粒物質(zhì)進(jìn)入系統(tǒng)的情況而定。

 

壓力的增大提示我們,或許是應(yīng)換過濾膜的時(shí)候了。 建議每天使用系統(tǒng)時(shí)都要做壓力變化的日志。要檢查系統(tǒng)壓力開始升高是否是系統(tǒng)上的第一個(gè)過濾膜引起的。等待壓力的下降。在系統(tǒng)內(nèi)還有壓力時(shí)不要拆除 HPLC 系統(tǒng)。斷開過濾器后面的管道,讓流動(dòng)相流過過濾器。記錄此時(shí)的壓力后拆除過濾器,再記錄壓力值,然后用前面的記錄值減去此值。如果差值大于 8-10 bar(或 100 psi),就應(yīng)換掉這個(gè)過濾膜。

 

用同樣的方式檢查其它的過濾膜。

 

注意！拆除過濾器前,一定要確保電化學(xué)電池被斷開和系統(tǒng)壓力低于10 bar。

 

如果過濾膜需更換的頻率過于頻繁,就要對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步的檢查。可根據(jù)下面的方法確定堵塞過濾膜的顆粒來源。如果泵后面的過濾膜需經(jīng)常更換,說明流動(dòng)相(包括長菌)或泵的密封圈有可能出了問題；

 

如果進(jìn)樣器后面的過濾膜需經(jīng)常更換,說明樣品有可能有問題；如果柱子后面的過濾膜需經(jīng)常更換,說明問題可能出自柱子。雖然記住這些將會(huì)得到解決問題的很好指導(dǎo),但也不是絕對(duì)的。當(dāng)處理 HPLC 系統(tǒng)的壓力問題時(shí),一定要充分做好系統(tǒng)分析和邏輯思考,盡量想到各方面的可能性。

 

13、我能用硝酸清洗電化學(xué)電極嗎

不建議用硝酸清洗電化學(xué)電極。只有在其它方法處理不再有效時(shí),才用硝酸做電化學(xué)電極的最后一次清洗。 決不能讓色譜柱接觸硝酸。有關(guān)電化學(xué)電極的清洗說明請(qǐng)參見Coulometric Sensor Technical Note文獻(xiàn)號(hào):70-1989。

 

當(dāng)用硝酸處理電化學(xué) 電極時(shí)決不能給其施加電勢。用硝酸清洗電化學(xué)電極將使電化學(xué)電極的所有保修為無效?？捎?N硝酸來清洗或鈍化EC-HPLC系統(tǒng)的不銹鋼件。有關(guān)用硝酸清洗電化學(xué)電極的指導(dǎo)說明可參見Coulochem II 操作手冊(cè)的8。5部分。 如果用硝酸鈍化HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼件, 可參見Coulochem II 操作手冊(cè)的4。3部分。

 

14、閥門的故障處理

造成兩次進(jìn)樣所得的峰響應(yīng)不太一致的原因可能是因進(jìn)樣方法或進(jìn)樣器有問題。