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魚肝油中的維生素D3的測定方法

本文對樣品提取溶劑和提取方法進行優(yōu)化實驗，簡化樣品前處理步驟，此方法具有簡便易行、精密度高、回收率高的特點。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（日本島津，LC-20AT 泵，SPD- 20 AV 檢測器）；LC Solution 色譜工作站 （日本島津）；恒溫 SHA-CA 水浴振蕩器、電子分析天平：金壇市國旺實驗儀器廠；WSL-2A 比較測色儀：上?，F(xiàn)科儀器有限公司；SZC-C 脂肪測定儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷（均為分析純）；正己烷、異丙醇（均為色譜純）；VD3 標準品：Sigma；魚肝油為抽檢樣品。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Rx-SIL（5 μm，4.6 mm× 250 mm）；流動相：正己烷：異丙醇（體積分數(shù)比）95∶5；流速：1.0 mL/min；檢測波長：264 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：100 μL。

1.3.2 標準溶液的制備

準確稱取 10.00 mg 的 VD3 標準品于小燒杯中，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中，搖勻，得到濃度為 100 μg/mL 的標準儲備液。

1.3.3 樣品溶液的制備

準確稱取 5.00 g 樣品于 100 mL 的容量瓶中，先用適量正己烷使其溶解，再用正己烷定容至刻度，劇烈振蕩 2 min，靜置分層，取上層有機相過 0.45 μm 的有機濾膜備用，以供液相分析。

2 分析與結(jié)果

2.1 檢測波長的確定

參照文獻可知，運用紫外掃描儀進行圖譜掃描，得出此條件下的最大吸收波長為 264 nm。

2.2 流動相的確定

對以下幾種正己烷∶異丙醇（體積分數(shù)比）80∶20、 85∶15、90∶10、95∶5 進行單因素試驗，綜合考慮色譜峰、保留時間、分離效果得出最佳流動相比例為正己烷∶異丙醇體積分數(shù)比（體積分數(shù)比）95∶5。

2.3 柱溫的確定

柱溫升高的同時，極性和非極性溶質(zhì)的容量因子會隨著減小，從而會縮短保留時間。柱溫并不是越高越好，在整個的升溫過程中可得到塔板高的一個最小值，此時的柱效達到最高[10]。結(jié)合儀器本身其它部件的耐受程度，最終確定最佳柱溫為 40 ℃。

2.4 流速的確定 因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于廠家來說，每一根特 定的色譜柱，都對應有一個最佳流速。本實驗的最佳流速為1.0 mL/min。

2.5 樣品溶劑的確定

本實驗研究的是從魚肝油中提取 VD3 ，因為 VD3 是脂溶性的，易溶于有機溶劑，因此嘗試直接用有機溶劑溶解樣品，稀釋上機。又考慮到樣品本身對色譜柱的影響，要求每次進樣的樣品濃度低于 10 g/100 mL。

在溶劑的選擇上，分別用丙酮、石油醚、正己烷、乙 酸乙酯溶解油樣，定容，過 0.45 μm 的有機濾膜上機。

測量的結(jié)果顯示乙酸乙酯誤差最大，丙酮、正己烷、石 油醚無明顯差異。同時考慮到溶劑本身對色譜柱的影響，綜合分析得出正己烷作為溶劑最合適，測量結(jié)果準 確，對柱子的損壞最小。

2.6 標準品及樣品的色譜圖

根據(jù)檢測波長、流動相、流速、柱溫等色譜條件討論，參考標準GB 5413.9-2010《嬰幼兒食品和乳品中維 生素  A、D、E》的測定中給出VD的進樣量，得出最佳色譜條件為檢測波長 264 nm、流動相為正己烷∶異丙醇（體積分數(shù)比）95∶5、柱溫40℃、流速為1.0 mL/min、進樣量 100 μL。

取抽檢的魚肝油按照 1.3.3 的要求制備樣品溶液， 同時按 1.3.2 的標準儲備液進行稀釋，選擇的上述最佳色譜條件對樣品溶液及標準溶液進行色譜分析，以保 留時間定性和外標法定量，得出的標準品及樣品的色譜圖如圖1 和圖 2。

2.7 標準曲線及檢出限的確定

準確吸取VD3的標準儲備液0.20、0.80、2.00、5.00、20.00 mL 于 100mL 棕色容量瓶中，用分析純正己烷溶解定容至刻度混勻。得到濃度分別為0.20、0.80、2.00、 5.00、20.00 μg/mL 的標準品溶液。按照本方法的最佳色譜條件進行測定。以峰面積為橫坐標，以 VD3的標準品濃度為縱坐標繪制標準曲線。同時以3倍儀器響應值標準偏差與標準曲線斜率的比值來計算儀器的檢測限，10 倍噪音比來確定定量限。實驗結(jié)果表明本方

法的靈敏度較高，能滿足實際測定的要求。其結(jié)果見表 1。

2.8 精密度和回收率的測定

采用本方法對抽檢的已知VD3含量的魚肝油中加入高、中、低 3 個濃度的標準液，每個濃度重復測量4 次求平均值進行精密度和回收率測定，其結(jié)果見表2。

由表 2 可知，采用本方法測得的數(shù)據(jù)結(jié)果表明其回收率和精密度都達到了很高的要求。平均回收率為94.2 %，RSD 為 0.62 %，結(jié)果可靠。

2.9 不同來源的魚肝油中 VD3的含量測定

以抽檢的幾批不同廠家的魚肝油為研究對象，運用本實驗的最佳色譜條件進行測定，外標法定量，其結(jié)果見表3。

由表 3 的測量結(jié)果顯示，抽檢的不同廠家的魚肝油中 VD3的含量存在明顯的差異，甚至同一廠家的不同批次的魚肝油中 VD3含量也有明顯差異，這可能跟原料的處理、加工工藝等因素有關(guān)。

3 結(jié)論

本文建立了一種新的快速測定魚肝油中VD3含量的分析方法。通過對色譜柱、檢測波長、流動相、流速等多個影響因素進行詳細分析最終得出最佳的色譜條件。該方法中 VD3濃度在 0.2 μg/mL～20 μg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與含量具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），平均相對標準偏差為 0.62 %，平均回收率為 94.2 %。同時對樣品的前處理進行了很大的改進，經(jīng)過多次實驗的準確驗證，得出此方法具有簡便易行、分離效果好、精密度高、回收率高的特點。