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前言

流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、測(cè)量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點(diǎn)，已經(jīng)成為近代科學(xué)研究中的熱門(mén)專題，研究它的論文數(shù)量也在逐年上升。流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞術(shù)為核心技術(shù)，集光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)以及激光和計(jì)算機(jī)等多門(mén)學(xué)科和技術(shù)于一體的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)備。它被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物學(xué)、微生物學(xué)、制藥學(xué)、生殖學(xué)等領(lǐng)域，是現(xiàn)代科學(xué)研究中的先進(jìn)儀器之一，被譽(yù)為實(shí)驗(yàn)室的"CT"。

1 流式細(xì)胞儀的工作原理和技術(shù)指標(biāo)

1.1 流式細(xì)胞儀工作原理

圖1為流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)。它主要有四部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；光源與光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集與信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng)。具有分選功能的流式細(xì)胞儀還包括分選系統(tǒng)。將待測(cè)細(xì)胞熒光染色后制成單細(xì)胞懸液，在鞘液的包被下單行排列，依次通過(guò)流動(dòng)室檢測(cè)區(qū)域。以激光作為激發(fā)光源，垂直照射檢測(cè)區(qū)域的樣品流，被熒光染色的細(xì)胞在其照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，它們同時(shí)被前向光電二極管和側(cè)向90°方向的光電倍增管接收。前向小角度的光散射信號(hào)（forward scatter,FSC）反映了細(xì)胞體積的大??；側(cè)向90°方向的光散射信號(hào)（side scatter，SSC）反映了細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜情況。激發(fā)熒光信號(hào)代表了所標(biāo)記的被測(cè)細(xì)胞內(nèi)部顆粒的信息。這些光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，被傳送到計(jì)算機(jī)，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C(jī)處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存到計(jì)算機(jī)上，以備脫機(jī)后的數(shù)據(jù)處理和分析。細(xì)胞的分選是將待測(cè)液滴充以正負(fù)不同的電荷，讓其在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入不同的收集容器中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。

圖 1 流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)

流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、分析參數(shù)多少及分析、分選速度及純度等。熒光分辨率是指分辨兩個(gè)相鄰峰的最小距離，通常用變異系數(shù)（CV值）來(lái)表示?，F(xiàn)在市場(chǎng)上主流型號(hào)的熒光分辨率小于2.0%，有的甚至在1%之內(nèi)。熒光靈敏度反映了儀器探測(cè)最小熒光光強(qiáng)的能力，一般用熒光微球上可測(cè)出的熒光（FITC）的最小分子數(shù)來(lái)表示。目前儀器可以達(dá)到100以內(nèi)。一般分析速度為500-10000個(gè)細(xì)胞/s，分選速度控制在1000個(gè)細(xì)胞/s以下，分選純度>98%,有的儀器（如 MoFLo High-Performance Cell Sorter）分析速度可達(dá)100000個(gè)細(xì)胞/s，分選速度可達(dá)70000個(gè)細(xì)胞/s，分選純度>98%。應(yīng)用方向不同，分析參數(shù)的多少差異較大，少的（如Guava PCA-96）可以分析3個(gè)熒光參數(shù)和1個(gè)散射信號(hào)，多的（如CyFlow SL）可以分析13個(gè)熒光參數(shù)和3個(gè)散射信號(hào)。

2 流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

2.1 在臨床上的應(yīng)用

細(xì)胞癌變過(guò)程中伴隨細(xì)胞DNA含量的改變，DNA非整倍體細(xì)胞是惡性腫瘤的特異性標(biāo)志。流式細(xì)胞儀的FSC能夠給出這些信息，在腫瘤的早期診斷和鑒別診斷中有著很重要的作用；早在80年代人們發(fā)現(xiàn)特定T細(xì)胞亞群可以反映AIDS患者的臨床狀態(tài)，而流式細(xì)胞儀可以對(duì)這些T細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，為AIDS的診斷、治療提供有用信息；流式細(xì)胞儀借助于各種熒光染料測(cè)定一個(gè)細(xì)胞的多種參數(shù)完成白血病及淋巴瘤的診斷，準(zhǔn)確率達(dá)90%左右，較傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢查準(zhǔn)確性提高10%-20%；流式細(xì)胞儀對(duì)淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)量的檢測(cè)，可以探索疾病的發(fā)病機(jī)理、病程、預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療方案。

2.2 在生物學(xué)及微生物學(xué)上的應(yīng)用

從早期到現(xiàn)在，在細(xì)胞及細(xì)胞器方面很多已被人們所接受的科技，都經(jīng)流式細(xì)胞儀研究過(guò)。在細(xì)胞功能的早期研究中，研究者僅能通過(guò)觀測(cè)微生物的吞噬來(lái)研究噬中性粒子,而流式細(xì)胞儀可以通過(guò)它們的大小、形狀、抗體及吞噬過(guò)程中微生物種類、數(shù)量的變化更深入的辨別、研究這些噬中性粒子；氧自由基的實(shí)時(shí)、單細(xì)胞繁殖評(píng)價(jià)，DNA倍體分析，細(xì)胞循環(huán)中細(xì)胞增殖和凋亡分析等都會(huì)用到流式細(xì)胞儀；流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期可以輕松分析，促進(jìn)了以此為基礎(chǔ)的植物學(xué)的發(fā)展，輔以成像儀器，流式細(xì)胞儀可以對(duì)微生物的成長(zhǎng)、繁殖進(jìn)行3-D研究。

2.3 在生殖學(xué)及制藥學(xué)上的應(yīng)用

利用對(duì)精子DNA進(jìn)行無(wú)害標(biāo)定的DNA染料(如Hoechst 33342)或H-Y抗體都可以對(duì)精子進(jìn)行檢測(cè)和分類，完成生殖學(xué)上的要求；FCM檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，對(duì)檢測(cè)臨床腫瘤化療效果及藥物的選擇有一定的意義。此外，流式細(xì)胞儀在細(xì)胞毒，可溶性蛋白質(zhì)分子，鈣離子濃度檢測(cè)等都有很廣泛的用途。此外，流式細(xì)胞儀在細(xì)胞毒，可溶性蛋白質(zhì)分子，鈣離子濃度檢測(cè)等都有很廣泛的用途。

3 流式細(xì)胞儀的最新發(fā)展

3.1 儀器功能專業(yè)化

Partec CyFlow、BD FACSCount可以實(shí)現(xiàn)CD4,CD8,CD3絕對(duì)計(jì)數(shù)，用于HIV檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)普及型流式細(xì)胞儀。

3.2 儀器全面自動(dòng)化

免疫標(biāo)本制備儀、組織樣本制備儀和樣品前處理儀在實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。不同規(guī)格的多孔板或多試管自動(dòng)進(jìn)樣器加速了自動(dòng)化進(jìn)程。Epics XL、FACSCalibur 等主流廠家儀器都實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。

3.3 多色多參數(shù)分析迅速發(fā)展，分析、分類速度加快

新興熒光探針的不斷開(kāi)發(fā)和儀器軟、硬件的逐步更新，流式細(xì)胞儀的多色熒光分析得到了迅速發(fā)展，對(duì)細(xì)胞亞群的識(shí)別更準(zhǔn)確、更精細(xì)。

3.4 儀器小型化

適應(yīng)實(shí)際需要的小型化、便攜式流式細(xì)胞儀也是一個(gè)發(fā)展的趨勢(shì)。最近幾年，微流體流式細(xì)胞儀成為研究的熱門(mén)方向，在這方面的研究也越來(lái)越多，取得了一定的科研成果。

3.5 儀器功能增強(qiáng)化

鑒于拉曼光譜易于識(shí)別的特點(diǎn)，Dakota A. Watson 等對(duì)能夠探測(cè)拉曼光譜的流式細(xì)胞儀進(jìn)行了研究，這將使細(xì)胞的多參數(shù)測(cè)量提升一個(gè)檔次。

3.6 理論的新發(fā)展

An-Shik Yang等采用SIMPLEC迭代算法對(duì)流式細(xì)胞儀液體流動(dòng)的理論模擬結(jié)果與文獻(xiàn)公布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合很好，為微流體流式細(xì)胞儀的流體室設(shè)計(jì)提供了理論參考。

另外，試劑盒熒光試劑、液相芯片技術(shù)、定量流式細(xì)胞分析、儀器模塊化等也是流式細(xì)胞儀的發(fā)展趨勢(shì)。

4 未來(lái)展望

本文對(duì)流式細(xì)胞儀的原理、應(yīng)用、發(fā)展現(xiàn)狀和趨勢(shì)作了簡(jiǎn)明扼要的論述，使科研者和使用者有一個(gè)更深刻的了解和認(rèn)識(shí)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，流式細(xì)胞儀專業(yè)化區(qū)分更加明顯，科研型大型儀器和普及性應(yīng)用儀器成為兩個(gè)主流；隨著光電技術(shù)的發(fā)展，相信流式細(xì)胞儀能夠在測(cè)量多色熒光參數(shù)的時(shí)候，給出多參數(shù)分析結(jié)果，同時(shí)完成分類，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)同步分析的功能，這對(duì)臨床醫(yī)療快速診斷意義重大。