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HPLC-ICP-MS分析雄黃在大鼠臟器中代謝的砷形態(tài)

1 引言 
　　近年來，中藥慢性中毒問題受到人們的高度重視。中藥雄黃在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有著悠久的歷史，具有解毒殺蟲，燥濕祛痰，截瘧等功效[1]。2010 年版《中國(guó)藥典》[1]規(guī)定雄黃飲片中As2S2的含量應(yīng)不低于90%，并對(duì)As2O3的量進(jìn)行了限制?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，雄黃在治療白血病[2]、癌癥[3]等惡性疾病方面也有不錯(cuò)的療效。盡管雄黃具有這種獨(dú)特的療效，但由于其屬于含砷礦物藥，使其具有一定的毒性，而其毒性大小與砷的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)[4～6]。Rana等[7]報(bào)道了，砷暴露可通過干擾抗氧化防御系統(tǒng)和減小SOD2 的基因表達(dá)，從而對(duì)肝、腎造成損傷。 
　　目前，測(cè)定砷形態(tài)的分析方法主要有高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC ICP MS）[8～10]、高效液相色譜與氫化物發(fā)生 原子熒光聯(lián)用技術(shù)（HPLC HG AFS）[11，12]、高效液相色譜與氫化物發(fā)生 原子吸收聯(lián)用技術(shù)（HPLC HG AAS）[13]、毛細(xì)管電泳與電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE ICP MS）[14，15]、高效液相色譜與電噴霧離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC ESI MS）[16]，主要用于食品等領(lǐng)域的測(cè)定，未見在雄黃代謝中應(yīng)用的報(bào)道。 
　　本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC ICP MS測(cè)定雄黃在大鼠肝腎中代謝砷形態(tài)的方法，為研究雄黃在大鼠體內(nèi)的代謝提供支持，同時(shí)考察了樣品前處理過程中砷形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，并運(yùn)用此法對(duì)雄黃在大鼠肝、腎中代謝后的砷形態(tài)進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步研究雄黃的藥代動(dòng)力學(xué)提供合適的方法。 
 

　　2 實(shí)驗(yàn)部分 
　　2.1 儀器與試劑 
　　1200 型高效液相色譜儀及7500a 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP MS，美國(guó)Agilent 公司）；Dionex IonPac AS19 陰離子交換柱（250 mm × 4 mm， 10 μm）；Milliplus 2150 超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；數(shù)控超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）。 
　?。∟H4）2CO3， NH3?H2O， H2O2（30%）、冰醋酸、NaCl均為優(yōu)級(jí)純；砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：亞砷酸根離子＼[As]、 砷酸根離子＼[As]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜堿（AsB），均購于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。超純水（電阻率18.2 MΩ?cm）。 
　　2.2 質(zhì)譜與色譜條件 
　　ICP MS 條件：RF入射功率1450 W，載氣為高純氬氣，載氣流速0.65 L/min，輔助氣流速0.45 L/min， 射頻電壓1.72 V，采樣深度7.8 mm，泵速0.3 r/s，檢測(cè)同位素 75As和35Cl。 
　　HPLC 條件：Dionex IonPac AS 19 陰離子分析柱；流動(dòng)相： 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7）；流速：1.2 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣體積：25 μL。 
　　2.3 染毒方法 
　　取4周齡Wistar大鼠4只，體重（50 ± 10）g。分為低、中、高劑量組，給藥劑量分別為0.3， 0.9和2.7 g/kg （以0.5% CMC 為混懸介質(zhì)），對(duì)照組給予0.5 % CMC （羧甲基纖維素鈉），雄黃染毒組灌胃給藥，每天灌胃1 次，連續(xù)6星期。染毒期間每3 天稱重1 次，調(diào)節(jié)灌胃劑量。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室溫度（24±1） ℃， 相對(duì)濕度（50±5）%，每天12 h光照，動(dòng)物可自由攝食攝水。于末次給藥2 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肝臟和腎臟。 
　　2.4 樣品前處理方法 
　　稱取0.3～0.4 g （精確到0.001 g）粉碎后的試樣，加38 mL 水、2 mL 3%乙酸溶液，渦旋混勻后，60 ℃ 水浴超聲2 h， 于4 ℃ 冰箱中靜置5 min后，取出，于4 ℃以9000 r/min離心10 min，上清液過0.2 μm濾膜。同時(shí)制備各試劑空白溶液。 
 

　　3 結(jié)果與討論 
　　3.1 色譜條件的優(yōu)化 
　　陰離子交換色譜和陽離子交換色譜均可用于砷形態(tài)分析。根據(jù)砷化合物的離子特性，陰離子交換色譜通常用來分析As、As、MMA 和 DMA，而陽離子交換色譜用于分離AsB、AsC、TMAO 和TETRA。 
　　在陰離子交換色譜中，AsB 和As在中性pH 條件下于死體積處共洗脫。通過向流動(dòng)相中加入酒石酸后，使As與酒石酸形成陰離子的絡(luò)合物，在色譜柱內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的保留特性，從而使As與AsB 分開[17]。也可通過增大pH值至9.0 以上[18]或?qū)s氧化成As實(shí)現(xiàn)與AsB 的分離。 
　　本實(shí)驗(yàn)采用Dionex IonPac AS 19陰離子色譜柱，以20 mmol/L （NH4）2CO3 作流動(dòng)相，對(duì)流動(dòng)相的pH 值和流速進(jìn)行了優(yōu)化。