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在微生物實(shí)驗(yàn)室, 必須達(dá)到一定程度的無菌狀態(tài), 避免微生物污染。 假如在一個(gè)不潔的實(shí)驗(yàn)室或者早先打翻過樣品的地方做微生物實(shí)驗(yàn), 引入新的微生物污染樣品的幾率是很大的。

 

微生物的實(shí)驗(yàn)可以分為兩大部分：前期準(zhǔn)備和樣品檢驗(yàn)。

 

事實(shí)上，保持整個(gè)實(shí)驗(yàn)室清潔是非常重要的， 這樣就不用在滅菌前擔(dān)心太多了， 然而， 滅菌后必須保證樣品或者培養(yǎng)基免受污染。其實(shí)， 可以把滅菌想像成”一扇門”， 在培養(yǎng)基中或者一些設(shè)備比如吸管的微生物都在滅菌過程中被殺死了，沒有微生物困擾實(shí)驗(yàn)了。必須保證滅菌后的環(huán)境(門后的部分)的潔凈， 杜絕滅菌后的培養(yǎng)基和設(shè)備受到污染。

 

無菌的重要性

 

無菌技術(shù) – 高壓濕熱滅菌

要點(diǎn)	描述
原理	在壓力下產(chǎn)生的濕熱的蒸汽殺死微生物的營養(yǎng)體和孢子。
密封	滅菌鍋必須密閉以阻隔外部空氣， 避免空氣的存在會(huì)影響壓力并降低滅菌鍋里面的溫度。
滅菌壓力	在滅菌鍋內(nèi)，合適的滅菌溫度是通過壓力達(dá)到的， 壓力對于滅菌沒有效用但是使蒸汽溫度上升。 對于標(biāo)準(zhǔn)操作來說，15lbs/inch2時(shí)的121℃并趕走所有空氣可以達(dá)到滅菌的效果。
滅菌時(shí)間	當(dāng)?shù)竭_(dá)一定的溫度和壓力時(shí)， 需要保持一定的時(shí)間來達(dá)到效果，為了殺滅微生物，121℃必須保持至少15分鐘。
培養(yǎng)基的滅菌	大部分情況下，實(shí)驗(yàn)室配置培養(yǎng)基后應(yīng)滅菌，滅菌時(shí)應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商指導(dǎo)， 使用合適的溫度時(shí)間； 有些培養(yǎng)基不適合滅菌的。
器皿的滅菌	當(dāng)滅菌器皿時(shí)，需要考慮使用數(shù)量，比如，一天用10根吸管，在滅菌時(shí)， 一般就可以以10根為一包， 這樣可以減低器皿在使用過程中遭受微生物的污染的可能性。
滅菌條	在滅菌過程中，可以用滅菌條來監(jiān)控效果， 滅菌條在滅菌前是有顏色的，滅菌后會(huì)變成黑色。
重新滅菌	假如一次滅菌無效，可以重新進(jìn)行滅菌過程， 但是，培養(yǎng)基是不可以進(jìn)行第二次滅菌的， 應(yīng)拋棄。
儲(chǔ)存	滅菌完成后， 培養(yǎng)基和器皿應(yīng)妥善儲(chǔ)存。 一般來說， 培養(yǎng)基應(yīng)存放于避光的潔凈空間，同時(shí)應(yīng)參照供應(yīng)商的指示。

 

無菌技術(shù) – 過濾 (Filtration)

要點(diǎn)	描述
簡述	物理分離方法，使用高效過濾將微生物從液體培養(yǎng)基分離。
	由于不需要加熱和冷卻過程，過濾比高溫濕熱滅菌省時(shí)間。
過濾頭	0.2微米的過濾頭可以分離所有的細(xì)菌營養(yǎng)體, 把它安裝在針筒末端。

 

無菌過程注意點(diǎn)

要點(diǎn)	描述
綜述	一旦培養(yǎng)基或者器皿經(jīng)過滅菌過程, 這種滅菌狀態(tài)應(yīng)保持直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
區(qū)域	最好能把培養(yǎng)基準(zhǔn)備區(qū)域(門外)和實(shí)驗(yàn)區(qū)域(門內(nèi))之間應(yīng)該設(shè)有緩沖間。
工作臺(tái)面	工作前必須消毒, 可以用70%的酒精, 也可以用含氯的消毒劑。
消毒時(shí)間	不管使用何種消毒劑，需要提供充分的消毒時(shí)間來殺滅微生物，一般5-10分鐘，可以用紙巾擦干表面。
潔凈臺(tái)	必須有2個(gè)光源：普通照明用和殺菌紫外光。紫外燈用于保持工作臺(tái)面免于微生物污染，在使用前仍然需要使用消毒劑清潔。
擺放	應(yīng)該有好習(xí)慣把工作桌面的物品擺放好,，把移動(dòng)放到最低限度， 避免帶來污染。
鑷子	如果使用薄膜過濾法，需要準(zhǔn)備一個(gè)小燒杯并有少量酒精， 鑷子不用時(shí)就放在杯子里。
培養(yǎng)基	培養(yǎng)基使用前，應(yīng)該有相關(guān)日期，比如配置日期， 或者實(shí)驗(yàn)室收到日期(直接使用的培養(yǎng)基)。假如沒有所需日期, 這個(gè)培養(yǎng)基不能使用。
實(shí)驗(yàn)服	穿著干凈的實(shí)驗(yàn)服，袖子應(yīng)卷起至肘部以避免碰到培養(yǎng)基或樣品帶來污染，當(dāng)然。做實(shí)驗(yàn)前要洗手。

 

實(shí)驗(yàn)的無菌技術(shù)注意點(diǎn)

采樣	個(gè)人衛(wèi)生	酒精燈
樣品應(yīng)無菌采得	萬一培養(yǎng)基或者樣品濺到實(shí)驗(yàn)服上，應(yīng)在做完一個(gè)實(shí)驗(yàn)后換上干凈的。	使用本森燈或者酒精燈, 在實(shí)驗(yàn)前點(diǎn)燃。
使用無菌采樣袋或者采樣瓶	咳嗽或者鼻塞可能會(huì)帶來微生物并影響實(shí)驗(yàn)，應(yīng)戴好防護(hù)手套面罩。	火焰在實(shí)驗(yàn)區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)防護(hù)層，可以防止那些懸浮在空氣中的微生物掉落在工作臺(tái)面上或者培養(yǎng)基上。
采樣員應(yīng)戴防護(hù)手套，在采樣前燒采樣口
樣品容器應(yīng)緊閉并安全儲(chǔ)存。
開瓶	瓶口	培養(yǎng)皿
開瓶前， 應(yīng)用清潔劑的紙巾清潔瓶蓋和附近區(qū)域，除去蓋子上可能留存的微生物。	蓋子打開后，玻璃瓶口應(yīng)進(jìn)行滅菌，可以在酒精燈上方旋轉(zhuǎn)瓶口和螺紋， 一般2-3秒。	當(dāng)打開培養(yǎng)皿時(shí)，不能完全移除蓋子，而應(yīng)該保持在培養(yǎng)皿的上側(cè)，從而能夠倒入培養(yǎng)基或者樣品，這樣可以減少空氣灰塵或者微生物的污染。
		倒完培養(yǎng)基或者樣品后，瓶口重新過火，蓋蓋子，用消毒劑清潔。

 

濾膜		鑷子
打開薄膜包裝， 絕對不能碰到薄膜!		用鑷子轉(zhuǎn)移濾膜
用鑷子把薄膜移除包裝并放到過濾頭上，過濾的漏斗不能完全移開，只需移開一點(diǎn)點(diǎn)放入濾膜即可		過火時(shí)，拿住鑷子的尾部， 放到火焰上，保持一下能夠到火就好，時(shí)間太長會(huì)在尖部結(jié)碳
過濾完后，用鑷子把濾膜轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中，放置于中間。		拿鑷子的時(shí)候，尾部向上直至燒完。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)束	打掃
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱；剩余的培養(yǎng)基可以放回儲(chǔ)存區(qū)域， 蓋子必須蓋緊。	拋棄廢棄物，比如樣品袋; 可回用的物品放在遠(yuǎn)離工作區(qū)域的地方以回收, 清洗, 滅菌。
	用含有消毒劑的紙巾清潔工作臺(tái)面。

 

廢棄物

在實(shí)驗(yàn)過程中暴露于微生物的物品應(yīng)作為有害廢棄物

這些廢棄物可能含有微生物并致病; 假如含有致病菌可能會(huì)產(chǎn)生公共衛(wèi)生的事件.

最好廢棄物能夠進(jìn)行濕熱滅菌

 

從微生物的實(shí)驗(yàn)室布局角度

一個(gè)設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)室能提供一個(gè)合格的環(huán)境以支持實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虬踩行У剡M(jìn)行。 首先，需要為實(shí)驗(yàn)室選擇一個(gè)合適的物理位置：

遠(yuǎn)離其他操作區(qū)域，比如，生產(chǎn)或者儲(chǔ)運(yùn)；

沒有從其他區(qū)域進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的直接入口；

實(shí)驗(yàn)室必須是微生物實(shí)驗(yàn)專用；

應(yīng)有專門微生物檢測無菌間，并通過緩沖間與準(zhǔn)備間等進(jìn)行區(qū)隔。

通風(fēng)和氣流	安保	工作區(qū)域
微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有單獨(dú)的通風(fēng)系統(tǒng)，與其他操作區(qū)域的空氣供給分開；	實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該是限制進(jìn)入的，可以是卡片控制或者其他方式，只有那些被允許進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的人員才能進(jìn)入。	實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)該有充足的工作區(qū)域，從GLP標(biāo)準(zhǔn)來說，每人應(yīng)有20平方米的區(qū)域。充足的工作區(qū)域可以避免工作中人員的碰撞，也避免了交叉污染。
空調(diào)系統(tǒng)的排氣必須直接排出實(shí)驗(yàn)室，空調(diào)系統(tǒng)應(yīng)定時(shí)清洗，并關(guān)注空氣過濾器的清潔。
易清潔	照明
實(shí)驗(yàn)室的墻面，屋頂和門都應(yīng)該是平滑的，光潔易于清洗消毒的；	實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充足的照明，包括不間斷電源或者備用發(fā)電機(jī).
墻的接縫包括強(qiáng)和墻之間，強(qiáng)和地面之間應(yīng)該是弧形的；
任何地方都應(yīng)該不能聚集灰塵，例如窗臺(tái)或者窗簾；
柜子應(yīng)該是可移動(dòng)的或者是不著地的以方便清掃。

 

遵照GLP相關(guān)的安全規(guī)則

 

1.GLP要點(diǎn) – 工作區(qū)域

要點(diǎn)	描述
總體安排	實(shí)驗(yàn)前應(yīng)做好儀器，試劑和培養(yǎng)基的所有準(zhǔn)備工作，這樣可以合理利用時(shí)間并得到穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
桌面安放	多余的培養(yǎng)皿，燒瓶或者濾紙可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)并帶來潛在的濺出，打碎或者交叉污染。
實(shí)驗(yàn)前消毒	在配制培養(yǎng)基或者開始試驗(yàn)前,應(yīng)該清潔并消毒工作桌面。可以采用70%的酒精溶液,含氯水的溶液,或者其他消毒劑。清潔后，應(yīng)等待幾分鐘以使有充分的時(shí)間殺滅微生物。
試驗(yàn)后消毒	實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,徹底清潔工作區(qū)域,仍然使用70%酒精溶液或者其他消毒劑,保持一段時(shí)間,然后擦干。
有害廢棄物的處置	必須有效管理微生物的有毒廢棄物，任何和微生物培養(yǎng)或者培養(yǎng)基相關(guān)的物品都應(yīng)被看作有害物質(zhì);因?yàn)樗麄兛赡芎兄虏【?需要小心處理。
廢棄物的滅菌	濕熱滅菌是最簡單也是最有效的處理污染物質(zhì)和有害物質(zhì)的方法。用過的培養(yǎng)皿應(yīng)放在滅菌袋中。滅菌后，可以當(dāng)作一般廢棄物處理。
重復(fù)使用器皿的滅菌	當(dāng)需要對小件物品(比如移液管)滅菌時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際用量分組包裝。濕熱滅菌后，袋包裝冷卻并保存。
避免浪費(fèi)	合理安排是非常重要的；實(shí)驗(yàn)室工作需要精準(zhǔn)，但是有時(shí)候我們也需要快速工作，因?yàn)榛ǚ浅６鄷r(shí)間會(huì)延長設(shè)備，培養(yǎng)基, 或者樣品暴露在環(huán)境中的時(shí)間。把需要用的物品放在手邊可以用的地方可以節(jié)約時(shí)間并提高工作的有效性。

 

2.GLP要點(diǎn) – 潔凈工作臺(tái)

 

簡介	使用	監(jiān)控
潔凈工作臺(tái)提供了控制來自環(huán)境的污染并提供工作區(qū)域的潔凈空氣。潔凈空氣吹向工作區(qū)域，同時(shí)，可以避免外部空氣進(jìn)入工作區(qū)域	使用時(shí)，紫外光線(或者紫外燈)應(yīng)關(guān)閉，但是使用后應(yīng)打開。如果紫外燈沒有打開工作臺(tái)沒有開啟，工作臺(tái)不能開始使用；必須清潔工作臺(tái)，開啟電源并打開紫外燈，保持30分鐘。	潔凈工作臺(tái)需要進(jìn)行日常的確認(rèn)，一般有第三方公司進(jìn)行。

 

一個(gè)有效的實(shí)驗(yàn)室

 

應(yīng)該是一個(gè)安全的實(shí)驗(yàn)室。 假如疏忽安全的話， 許多每天使用的培養(yǎng)基或者設(shè)備會(huì)產(chǎn)生危害。 減少這些危害帶來的風(fēng)險(xiǎn)不僅僅保護(hù)了工作場所， 更重要的是， 保護(hù)了自身免于危險(xiǎn)。

 

利用常識并遵照GLP相關(guān)的安全規(guī)則, 我們就能把由于微生物相關(guān)的行為帶來的潛在危害降低到最小。

安全用品		移動(dòng)
安全用品包含口罩，手套和眼部防護(hù)。		當(dāng)移動(dòng)培養(yǎng)基或者樣品時(shí)，應(yīng)小心注意以避免濺出或者潑出；
口罩防止培養(yǎng)基和樣品受到污染，可能來自于咳嗽或者鼻涕；根據(jù)當(dāng)?shù)氐囊蠛土?xí)慣, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)室會(huì)有不同的要求。		突然的移動(dòng)會(huì)產(chǎn)生安全危害或者導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無效；
戴手套是為了防止培養(yǎng)基或者其他刺激性物質(zhì)接觸皮膚；在從濕熱滅菌鍋內(nèi)取出容器或則器皿時(shí)，需要戴防熱手套。		不要使用夸張的動(dòng)作或者行為
在配置培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)中佩戴防護(hù)眼鏡是一個(gè)很好的習(xí)慣，能夠購買帶有屈光度的防護(hù)眼鏡為佳。		同時(shí)，不要把任何東西，比如吸管，放到嘴里。

 

 

明火		濕熱滅菌鍋
實(shí)驗(yàn)中需要用到酒精燈或其他明火, 但是假如使用不當(dāng)會(huì)帶來比較高的安全危險(xiǎn)；		濕熱滅菌鍋使用高壓下產(chǎn)生的蒸汽，溫度可達(dá)121℃，殺死了微生物，同樣可以帶來人類組織的灼傷，所以必須特別小心地操作;
確保酒精燈不用時(shí)完全關(guān)閉，當(dāng)有閥門時(shí)經(jīng)常檢查墊圈是否有裂痕或者泄露；		如此高的溫度以及蒸汽能帶來極大的潛在傷害，即使是殘留的蒸汽也能帶來很大的危險(xiǎn)。打開滅菌鍋時(shí)需要特別小心，站在邊上避免面對熱量和蒸汽，緩慢的打開門，同時(shí)，戴好防熱手套.
操作酒精燈時(shí)，應(yīng)確保火焰不會(huì)接觸衣物或者皮膚?？扇嘉锲?，比如記錄本，應(yīng)遠(yuǎn)離火焰以避免意外點(diǎn)燃；		把需要滅菌的培養(yǎng)基和器皿平均放置在托盤上，大的物品放在邊上，確保物品不會(huì)相互碰撞。這樣可以是熱量均勻擴(kuò)散并平衡整個(gè)托盤。
同時(shí)，要注意可燃液體的容器。每次使用后應(yīng)蓋好蓋子并遠(yuǎn)離酒精燈火焰；
使用火焰進(jìn)行滅菌工作時(shí)，可使用鑷子，把鑷子放在含有95%酒精的燒杯中，使用時(shí)，把鑷子在火焰上灼燒1-2秒，移開鑷子并等待火焰熄滅；
拿著鑷子是尖端應(yīng)向下，使熱的酒精不會(huì)流到手上。

 

 

潔凈臺(tái)	樣品操作
在潔凈臺(tái)工作時(shí)必須關(guān)閉紫外燈，紫外光線是危險(xiǎn)的；	培養(yǎng)基和樣品：用火焰灼燒瓶口時(shí)，停留4-5秒，旋轉(zhuǎn)使整個(gè)表面都能被灼燒，不要停留太久，不要濺出樣品或者培養(yǎng)基；
不要把手或者手指放在紫外燈下，以免灼傷皮膚；	假如樣品是瓶裝的，不要直接灼燒以免爆開?？梢匀?個(gè)燒杯，倒入70%酒精，把瓶子倒置放入一個(gè)燒杯中，使蓋子和瓶頸的2.5厘米處能浸沒在酒精中，拿出瓶子用干凈的布擦干；同理，放入第二個(gè)燒杯，拿出瓶子直立待酒精自然蒸發(fā)；
不要直接看紫外光線以免損傷眼睛。	開瓶時(shí)應(yīng)特別小心不能污染樣品，可以用消毒紙巾開旋蓋的瓶子；用浸沒在95%酒精并灼燒的開瓶器打開壓蓋瓶；
	打開瓶子后，使用相同的方法灼燒瓶口，并確保用于消毒的酒精完全揮發(fā)；
	拉罐可以使用相同的程序或者用含70%酒精的棉球擦拭頂部，假如罐子必須用開罐器，這個(gè)開罐器操作同開瓶器；
	無菌包裝的產(chǎn)品用含70%酒精的棉球擦拭。

 

 

微生物防護(hù)用具

1.一級防護(hù)（設(shè)備）

1.1移液輔助器，如移液器

1.2生物安全柜

1.3一次性塑料接種環(huán)、電熱接種環(huán)

1.4螺口蓋試管及瓶子

1.5高壓滅菌器

1.6一次性塑料移液管

 

2.二級防護(hù)（人員）

2.1工作服、防護(hù)服

2.2手套（乳膠手套等）

2.3安全眼鏡、面罩或其他防護(hù)用品

 

檢測中常見問題解答

 

細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)箱必須分開放置嗎？

在CNAS-CL01-A001-2018《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》有此規(guī)定：6.3.4 b)2）檢測樣品中的霉菌時(shí)，要有適當(dāng)?shù)拇胧┛刂奇咦釉诳諝庵械臄U(kuò)散。但未見到明確規(guī)定細(xì)菌培養(yǎng)箱和霉菌培養(yǎng)箱不能在同一房間的規(guī)定。一般實(shí)驗(yàn)室都有三種培養(yǎng)箱，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上分為兩種，一種是內(nèi)部循環(huán)風(fēng)溫度平衡的，第二種是內(nèi)外熱空氣流動(dòng)自動(dòng)平衡型的，另外第三種是熱輻射溫度平衡型的。有網(wǎng)友認(rèn)為，第一種和第三種應(yīng)該可以放在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，保持一定距離即可。第二種培養(yǎng)箱應(yīng)該不能放在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室。據(jù)說，CNAS現(xiàn)場評審，會(huì)提出細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)箱分開放置要求。