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免疫原性是指能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)引起免疫應(yīng)答的特性。免疫原性是抗原的特點(diǎn)之一，它能作用于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的抗原識(shí)別受體，使其增殖、分化，從而產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)，如特異性抗體和致敏淋巴細(xì)胞。免疫原性的強(qiáng)弱通常與分子量大小大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)。

 

具有免疫原性的物質(zhì)，通常來(lái)說(shuō)，分子量越大，免疫原性越強(qiáng)，分子量低于4000，一般不具有免疫原性，分子量在4000和10000之間，呈若免疫原性，分子量高于10000者，具有較強(qiáng)的免疫原性。但是有例外，比如比如明膠，分子量可達(dá)10萬(wàn)，但是呈弱免疫原性，因?yàn)樗侨菀捉到獾闹辨湴被峤Y(jié)構(gòu)。

 

免疫原性檢測(cè)是抗體藥物研發(fā)過(guò)程中必不可少的一步，需要在臨床前和臨床階段均開(kāi)展。具有免疫原性的藥物可能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有害的免疫反應(yīng)，能形成抗藥抗體（anti-drug antibody, ADAs）和中和抗體(neutralizing antibody, NAbs)。前者會(huì)引起患者強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，甚至危害病人生命安全，后者能夠中和能力，能夠抑制生物藥的生物活性而減弱其藥效。

 

因此，考慮到免疫原性會(huì)嚴(yán)重影響藥物的有效性和安全性，F(xiàn)DA等藥監(jiān)部門要求對(duì)所有生物藥都要進(jìn)行免疫原性的檢測(cè)。但是現(xiàn)在的預(yù)測(cè)手段不好，很多藥物直到臨床III期才發(fā)現(xiàn)ADA問(wèn)題。對(duì)企業(yè)來(lái)說(shuō)，這無(wú)疑增加了研發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和資本投入。

 

01、生物藥免疫原性來(lái)源

 

生物藥的免疫原性主要有兩個(gè)來(lái)源：內(nèi)源和外源。內(nèi)源免疫原性來(lái)自非人源的氨基酸序列、不同人的氨基酸序列和為了加強(qiáng)功效或者延長(zhǎng)半衰期而進(jìn)行的一些修飾（如點(diǎn)突變、糖基改動(dòng)、去海藻糖、加脂肪酸、PEG化、Fc融合，雙特異性抗體和多功能抗體等），這在藥物研發(fā)早期時(shí)就應(yīng)該考慮進(jìn)去。

 

外源免疫原性主要來(lái)源于CMC（CMC主要是指生產(chǎn)工藝，雜質(zhì)研究和質(zhì)量研究）、物料和運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)。比如，提高抗體表達(dá)量的同時(shí)糖基化沒(méi)有跟上，導(dǎo)致了多聚體的產(chǎn)生，多聚體是免疫原性的重要起因之一。再比如，常見(jiàn)的表面活性劑能引起強(qiáng)烈的機(jī)體免疫反應(yīng)。另外，給藥途徑、給藥頻率和給藥時(shí)間也可能影響蛋白質(zhì)的免疫原性。

 

02、如何檢測(cè)生物藥免疫原性

 

FDA建議對(duì)免疫原性風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)最好在IND階段和臨床I期開(kāi)展。對(duì)于高免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的生物藥，藥企應(yīng)在早期進(jìn)行預(yù)驗(yàn)證，并在樣本凍存前，進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)分析。通過(guò)FDA藥物認(rèn)證的條件之一是，有完全的蛋白免疫原性檢測(cè)報(bào)告。根據(jù)FDA指南，生物藥的免疫原性檢測(cè)主要包含以下3個(gè)步驟：

 

1、免疫原性篩選：檢測(cè)識(shí)別抗體蛋白藥的ADA。常用方法包括ELISA、ECL和RIA。

利用ELISA和ECL檢測(cè)ADA

 

2、ADA確認(rèn)：通過(guò)蛋白藥競(jìng)爭(zhēng)來(lái)驗(yàn)證ADA是否特異，排除假陽(yáng)性結(jié)果。

 

3、ADA表征：競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合分析、亞型分析、結(jié)合穩(wěn)定性分析、抗原表位特異性分析、結(jié)合穩(wěn)定性、中和能力分析。中和能力分析又被稱為中和檢測(cè)，常用方法為競(jìng)爭(zhēng)性配基結(jié)合（competitive ligand binding, CBL）。CBL是中和檢測(cè)的首選方法。

CLB檢測(cè)法檢測(cè)中和抗體

 

常用的免疫原性檢測(cè)方法

 

1、ELISA-橋法

 

對(duì)抗體藥物進(jìn)行免疫原性檢測(cè)是生物技術(shù)藥物申請(qǐng)臨床試驗(yàn)和注冊(cè)的重要內(nèi)容，盡管已有的動(dòng)物試驗(yàn)顯示免疫原性不一定會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生預(yù)期的免疫反應(yīng)，但對(duì)藥物免疫反應(yīng)的評(píng)價(jià)仍顯得十分重要。將抗原或抗體固定的過(guò)程稱為包被，換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過(guò)程。ELISA-橋法包被藥物，用標(biāo)記的藥物檢測(cè)。此法的優(yōu)點(diǎn)是能檢測(cè)各類抗體亞型，無(wú)種屬特異性，可高通量檢測(cè)，缺點(diǎn)是不易檢測(cè)到低親和力的抗體，包被或標(biāo)記時(shí)可能會(huì)掩蓋或改變藥物的抗原表位，易受藥物本身的干擾。

 

2、ELISA-直接法

 

抗體的包被一般均采用直接吸附法，蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。ELISA-直接法包被藥物，用標(biāo)記抗體檢測(cè)。ELISA-直接法用于免疫原性檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是可能會(huì)增加檢測(cè)低親和力抗體的能力，且高通量。然而當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法。而且直接包被時(shí)可能會(huì)掩蓋或改變藥物的表位，僅檢測(cè)單一亞型，有種屬特異性，多次洗滌時(shí)丟失低親和力抗體，參考品與樣本之間試劑可能不同。

 

3、ELISA-間接法

 

ELISA-間接法包被單抗或生物素，再加藥物，即先將針對(duì)該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法，試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。

 

4、放射免疫分析法（RIA）

 

RIA 是一種微量分析法，就是利用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，然后與被測(cè)的抗體或抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物的原理來(lái)進(jìn)行分析的。它兼有放射性同位素的靈敏性和抗原、抗體反應(yīng)的特異性兩大特點(diǎn)。該法還具有準(zhǔn)確性高和精密度好，便于標(biāo)準(zhǔn)化以及操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。由于RIA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、測(cè)量簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，RIA在應(yīng)用方面具有一定的生命力。但是，又因?yàn)樗钪旅娜觞c(diǎn)就是使用放射性核素，此外標(biāo)記物有效使用時(shí)間短，難以實(shí)現(xiàn)操作和測(cè)量的自動(dòng)化等，它的進(jìn)一步發(fā)展受到一些局限?，F(xiàn)在免疫分析技術(shù)都在朝著非同位素標(biāo)記免疫分析的方向發(fā)展。

 

5、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）

 

電化學(xué)發(fā)光法（ECL）源于電化學(xué)法和化學(xué)發(fā)光法，不僅可以應(yīng)用于所有的免疫測(cè)定，而且還可用于DNA／RNA探針檢測(cè)。它的優(yōu)點(diǎn)是液相法，可檢測(cè)各種抗體亞型，無(wú)種屬特異性、高通量，可使用高濃度基質(zhì)，檢測(cè)表面積大和信號(hào)穩(wěn)定。缺點(diǎn)是需制備2種標(biāo)記物（生物素和TAG），標(biāo)記物分子的表位可能會(huì)變化或標(biāo)記過(guò)程會(huì)改變分子，所用試劑通用性差。

 

6、表面等離子體共振

 

表面等離子體共振法的優(yōu)點(diǎn)是液相法，不需結(jié)合物（酶標(biāo)記抗體），能檢測(cè)到不同親和力的抗體和各亞型抗體，無(wú)種屬特異性。缺點(diǎn)是化學(xué)連接可能會(huì)影響分子，與葡聚糖連接影響表位的暴露，復(fù)性可能會(huì)使分子降解，所用試劑通用性差，低通量，如果產(chǎn)生的抗體是藥物同種亞型的抗體，要證實(shí)一種人源化抗體的抗抗體反應(yīng)比較困難，靈敏度低。

 

7、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISpot）

 

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISpot）的原理與ELISA類似，也是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白的方法，它不僅能測(cè)定細(xì)胞因子量，還可通過(guò)計(jì)數(shù)檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率，靈敏度高于ELISA，而且實(shí)驗(yàn)采用的捕獲抗體不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。缺點(diǎn)是比ELISA技術(shù)復(fù)雜而費(fèi)時(shí)，需嚴(yán)密控制實(shí)驗(yàn)條件，操作人員需技術(shù)熟練，并能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，以減少實(shí)驗(yàn)偏差；屬半定量方法。

 

8、免疫PCR法（IPCR）

 

免疫PCR法（IPCR）是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，用PCR擴(kuò)增代替ELISA的酶催化底物顯色。PCR具有很強(qiáng)的放大能力，可以定量地檢測(cè)DNA和RNA，具有非常高的靈敏度和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過(guò)連接分子與DNA結(jié)合，再經(jīng)PCR擴(kuò)增定量檢測(cè)抗原使得IPCR的靈敏性高于ELISA。與對(duì)應(yīng)的ELISA比較，IPCR至少可使抗體檢測(cè)的靈敏度提高1000倍，而且該法中僅僅采用稀釋的方法就可以消除生物樣品中基質(zhì)的干擾。

 

目前報(bào)道的IPCR均采用待檢抗原直接吸附固相，因此固相的均質(zhì)性對(duì)結(jié)果有很大的影響；同時(shí)檢測(cè)的樣品中其他成分也可以吸附固相，極易產(chǎn)生背景過(guò)高或精確度下降。有些難于吸附固相的抗原也就不能用免疫PCR檢測(cè)，連接分子的特異性和均質(zhì)性對(duì)PCR影響很大，PCR擴(kuò)增過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，如用微量板作為固相需選用配套的PCR儀，否則需將其移入反應(yīng)管內(nèi)，這必然導(dǎo)致很大的誤差，經(jīng)放大可產(chǎn)生顯著差異。IPCR具有廣泛的應(yīng)用前景，但有必要進(jìn)一步完善IPCR的實(shí)驗(yàn)過(guò)程和配套試劑的研制。

 

抗體類藥物免疫原性檢測(cè)不僅僅是藥物治療效果的問(wèn)題，更是藥物安全性的問(wèn)題，人們對(duì)抗抗體的副作用目前仍不明確。但抗抗體產(chǎn)生對(duì)藥物本身的影響以及潛在的過(guò)敏反應(yīng)不容忽視，因此對(duì)抗體類藥物免疫原性檢測(cè)的工作需要不斷研究。