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針對目前國內(nèi)化學(xué)藥品復(fù)方制劑研究中存在有關(guān)物質(zhì)研究方法的不規(guī)范和限度確定的不合理, 本文建議在復(fù)方制劑的有關(guān)物質(zhì)研究中, 對各主成分的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分別研究和控制, 并對復(fù)方制劑中有關(guān)物質(zhì)定性歸屬的幾種研究方法進(jìn)行了討論。

關(guān)于化學(xué)藥品復(fù)方制劑雜質(zhì)來源歸屬研究的基本思路, 在之前的論著[ 1]中已經(jīng)進(jìn)行了討論。國內(nèi)的研發(fā)單位在進(jìn)行化藥復(fù)方制劑類品種的研究過程中, 有關(guān)物質(zhì)的研究很不規(guī)范, 在該類品種的技術(shù)審評中我們也注意到, 多數(shù)化藥復(fù)方制劑藥學(xué)方面的發(fā)補(bǔ)也多是由于有關(guān)物質(zhì)研究方法的不規(guī)范和限度的不合理造成, 導(dǎo)致注冊申請的延誤。由于化學(xué)藥物復(fù)方制劑在國內(nèi)藥品注冊申請中占有相當(dāng)比例,因此有必要對該類制劑有關(guān)物質(zhì)定性歸屬的研究方法進(jìn)行闡述, 希望能引起研發(fā)者的重視。

目前存在的主要問題

化學(xué)藥品復(fù)方制劑的有關(guān)物質(zhì)研究, 目前方法多采用HPLC法, 但在方法學(xué)研究上尚不深入, 研究者常采用復(fù)方中某一主成分單方制劑中有關(guān)物質(zhì)控制所用的色譜條件或僅進(jìn)行微小調(diào)整, 將幾種主成分進(jìn)行簡單分離后, 然后采用面積歸一化法或自身對照法, 以各主成分的峰面積之和(或某一主成分的峰面積)作為對照, 計算單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)的量,限度往往定為總雜質(zhì)或單個雜質(zhì)不得超過X%, 總雜質(zhì)不得超過Y%。不針對處方中各主成分的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分別研究和分別控制, 限度的確定沒有依據(jù), 可能存在較大的安全性隱患。

問題分析

由于歷史的原因, 目前國內(nèi)不少單方制劑的有關(guān)物質(zhì)限度多采用自身對照法, 僅限定單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)。這種質(zhì)控方法盡管與ICH的要求[ 2 -3] 還有差距, 但對相對控制藥品的質(zhì)量和保證藥品的安全有效也起到了積極的作用。然而, 這種方法對于控制復(fù)方制劑中的有關(guān)物質(zhì)則可能存在很大的風(fēng)險。

由于復(fù)方制劑中幾種主成分的量往往差別很大, 或者紫外響應(yīng)值不同, 表現(xiàn)在HPLC圖譜中, 幾種主成分常常有幾倍甚至幾十倍的積分面積差別。這時, 對于圖譜中積分面積較小的主成分, 其有關(guān)物質(zhì)在計算時往往會被忽略, 即使其有關(guān)物質(zhì)的量與其單方制劑相比已經(jīng)高很多時, 總有關(guān)物質(zhì)的量仍然符合申報的限度要求。這時, 該主成分的有關(guān)物質(zhì)就可能會產(chǎn)生安全性問題。

例如:某抗高血壓藥物A中存在一個毒性較大的已知雜質(zhì)A1 , A單方片劑的國外藥典標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定有關(guān)物質(zhì)限度為:已知雜質(zhì)A1 按自身對照法計算, 不得過0.3%, 其他單個未知雜質(zhì)不得過0.5%,總雜質(zhì)不得過1.0%。現(xiàn)國內(nèi)研究單位開發(fā)了某創(chuàng)新性復(fù)方制劑, 將A與某降脂藥B組成復(fù)方片。由于該復(fù)方中2種藥物的含量差別較大, 紫外響應(yīng)也不同, 從提供的HPLC圖譜中可以看出, 主成分B的HPLC積分面積為A的25 倍左右。研究單位在進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)計算時, 取供試品溶液的1%作為對照溶液, 以對照溶液中2種主成分A和B的峰面積之和作為對照, 對HPLC圖譜中出現(xiàn)的各個有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行計算。申報的標(biāo)準(zhǔn)中限度定為:單個雜質(zhì)不得過0.5%, 總雜質(zhì)不得過1.0%, 按申報的方法進(jìn)行計算, 3 批樣品的測定值為:已知雜質(zhì)A1 的量皆小于0.15%, 其他單個未知雜質(zhì)皆在0.2% ～ 0.32%,總雜質(zhì)在0.45% ～ 0.58%。按這種方法計算看似有關(guān)物質(zhì)的實測值很小, 但審評時我們發(fā)現(xiàn), 由于2種主成分的相容性問題, 主成分A的穩(wěn)定性較差,制成復(fù)方制劑后已知雜質(zhì)A1 有明顯增加, 按A單方片的計算方法進(jìn)行計算, 復(fù)方制劑中A1 的量已經(jīng)達(dá)到2.8% ～ 3.4%, 達(dá)到了原單方片的限度10倍左右, 但按自擬標(biāo)準(zhǔn)的計算方法計算卻只有0.11% ～ 0.13%, 不能反映出有關(guān)物質(zhì)的真實情況,計算方法明顯不合理。而由于存在相容性問題, 本品組分的合理性也有待進(jìn)一步商榷。該復(fù)方制劑中的有關(guān)物質(zhì)情況見表1。

針對上述問題, 我們建議在復(fù)方制劑的有關(guān)物質(zhì)研究中, 對各主成分的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分別研究和分別控制, 即經(jīng)歸屬研究后, 將復(fù)方制劑HPLC圖譜中出現(xiàn)的全部有關(guān)物質(zhì)逐一甄別歸屬為各主成分的有關(guān)物質(zhì), 然后針對各主成分分別計算有關(guān)物質(zhì), 在標(biāo)準(zhǔn)中像單方片一樣對各主成分的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分別控制, 避免“一鍋粥”式的研究和質(zhì)控方式。

定性歸屬方法

對各主成分進(jìn)行分別控制的基礎(chǔ)是:必須首先將各有關(guān)物質(zhì)分別甄別歸屬于各個主成分。對于該類歸屬研究, 很多研發(fā)人員認(rèn)為有一定難度, 進(jìn)行的研究很不深入。事實上, 由于有關(guān)物質(zhì)與主成分一般皆存在淵源關(guān)系, 因而僅進(jìn)行歸屬研究并非難事。歸屬的方法可以有多種, 較常使用的有HPLC峰保留時間對比法和HPLC-MS聯(lián)用方法等。

3.1HPLC峰保留時間對比法

峰保留時間對比法是采用HPLC法, 在相同的色譜條件下分別測定復(fù)方制劑以及處方中各個單一主成分(原料藥或相同輔料的單方片)的HPLC圖譜, 經(jīng)對比研究后將各個有關(guān)物質(zhì)歸屬為不同的主成分, 在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用相對保留時間(RRT)將各雜質(zhì)歸屬為不同的主成分, 然后分別進(jìn)行控制。HPLC峰保留時間對比法具有方便、快捷的優(yōu)點, 是復(fù)方制劑有關(guān)物質(zhì)研究的常用方法, 但該方法對于控制制成復(fù)方制劑后新增加的有關(guān)物質(zhì)則較為困難, 需要結(jié)合LC-MS等其他方法進(jìn)行研究后確定。不過, 我們?nèi)匀豢梢栽谫|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用相對保留時間來表征各有關(guān)物質(zhì)的歸屬情況。

3.2HPLC-MS聯(lián)用法

HPLC-MS聯(lián)用法[ 5] 是對復(fù)方制劑中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性歸屬研究最為有效的方法之一。該方法可以采用液質(zhì)聯(lián)用儀對復(fù)方制劑HPLC圖譜中出現(xiàn)的各個主要色譜峰分別進(jìn)行質(zhì)譜分析, 獲得各主要有關(guān)物質(zhì)的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖, 根據(jù)各有關(guān)物質(zhì)的分子離子峰及裂解后產(chǎn)生的碎片離子峰的信息進(jìn)行初步的質(zhì)譜分析, 從而推測有關(guān)物質(zhì)是由哪種主成分產(chǎn)生的。由于主成分與其相應(yīng)的有關(guān)物質(zhì)一般皆具有淵源關(guān)系, 可利用質(zhì)譜中出現(xiàn)的一些特征信息進(jìn)行歸屬。通常我們可以根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的分子離子峰、特征官能團(tuán)和特征元素進(jìn)行歸屬。

3.2.1根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的分子離子峰

組成復(fù)方制劑中的各主成分往往為上市多年的品種, 研發(fā)者一般已經(jīng)對各主成分中的各種有關(guān)物質(zhì)有了一定的了解, 或經(jīng)過分析主成分的合成工藝和結(jié)構(gòu)特點獲得有關(guān)物質(zhì)的可能結(jié)構(gòu), 然后在一級質(zhì)譜上根據(jù)各有關(guān)物質(zhì)的分子離子峰初步推斷歸屬為某主成分的有關(guān)物質(zhì)[ 5 -6] 。

3.2.2根據(jù)特征官能團(tuán)的特征峰

在質(zhì)譜圖中, 主成分及其有關(guān)物質(zhì)往往會出現(xiàn)一系列相似的特征碎片離子峰, 可根據(jù)這些特征峰的情況進(jìn)行歸屬。比如:主成分中如果含有苯磺?；?、氯/氟代苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、四氮唑等基團(tuán), 則其工藝雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的二級質(zhì)譜中一般也會出現(xiàn)這些基團(tuán)的特征峰[ 6] , 經(jīng)與主成分的質(zhì)譜圖進(jìn)行簡單對比即可進(jìn)行甄別歸屬。在多數(shù)情況下, 我們無需確定該有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)即可將其歸屬為某一主成分的有關(guān)物質(zhì)。例如:苯磺?；鶠檩^為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu), 如果某化合物結(jié)構(gòu)中含有苯磺酰基, 則其二級質(zhì)譜圖中一般都會出現(xiàn)m/e142的特征裂解峰。如果復(fù)方制劑中的某一主成分含苯磺?；Y(jié)構(gòu), 則二級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)m/e142峰的有關(guān)物質(zhì)即可初步確定為該主成分的有關(guān)物質(zhì)。

3.2.3根據(jù)特征元素產(chǎn)生的特征峰

某些元素在質(zhì)譜中會產(chǎn)生很強(qiáng)的特征峰, 可以有效幫助我們確定有關(guān)物質(zhì)的歸屬。例如:溴代產(chǎn)物在質(zhì)譜中會出現(xiàn)溴的特征質(zhì)譜峰[ 6] (m/e相差2、豐度相當(dāng)?shù)碾p峰), 如果復(fù)方制劑中的某主成分結(jié)構(gòu)中存在溴代基團(tuán), 則其有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)譜圖中也多會出現(xiàn)溴的特征峰, 對于歸屬研究具有很好的提示作用。

總結(jié)

以上為我們對復(fù)方制劑中有關(guān)物質(zhì)定性歸屬的研究方法的幾點認(rèn)識。需要說明的是, 定性歸屬僅僅是復(fù)方制劑有關(guān)物質(zhì)研究的第一步, 在完成歸屬后仍然需要進(jìn)行一系列的方法學(xué)研究才能最終確定方法。而且目前這種方法僅是對復(fù)方中各主成分的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分別歸屬和控制, 隨著我們對有關(guān)物質(zhì)研究的不斷深入, 對有關(guān)物質(zhì)控制的要求不斷提高, 對復(fù)方制劑中出現(xiàn)的每個有關(guān)物質(zhì)分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和分別控制也必然成為將來復(fù)方制劑有關(guān)物質(zhì)研究的趨勢。