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糖基化作為一種重要的翻譯后修飾，造成了蛋白類藥物分子結(jié)構(gòu)上的多樣性和異質(zhì)性，對(duì)有效性、安全性和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)都有重要影響。糖基化是生物類似藥和參照藥相似性評(píng)價(jià)的難點(diǎn)之一。本文以單克隆抗體藥物為例，介紹蛋白類藥物糖基化表征的常用方法以及審評(píng)工作中生物類似藥糖基化表征的技術(shù)考慮，為研發(fā)單位開發(fā)生物類似藥以及監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)糖基化相關(guān)的技術(shù)審評(píng)提供參考。

近年來，蛋白類藥物由于在腫瘤、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、心血管疾病等適應(yīng)證上，顯示出了作用靶點(diǎn)特異、療效突出、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，極大滿足了病患需求，已經(jīng)成為藥物研發(fā)的最重要領(lǐng)域之一［1］。然而，蛋白類創(chuàng)新藥物由于巨大的研發(fā)成本，且價(jià)格高昂，嚴(yán)重影響了藥物的可及性。各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)紛紛出臺(tái)政策法規(guī)指導(dǎo)和鼓勵(lì)生物類似藥的研發(fā)。2015年國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心發(fā)布了《生物類似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》后，國內(nèi)迎來了生物類似藥的研發(fā)熱潮，目前已陸續(xù)有相關(guān)產(chǎn)品獲批上市。

蛋白類藥物由于多數(shù)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系，細(xì)胞內(nèi)存在著復(fù)雜的翻譯后修飾和酶類反應(yīng)，造成了表達(dá)產(chǎn)物在糖基化分子結(jié)構(gòu)的多樣性，生產(chǎn)工藝和細(xì)胞株的微小變化都可能導(dǎo)致目的蛋白糖修飾基團(tuán)結(jié)構(gòu)上的明顯差異，因此，生物類似藥基本上無法做到與原研產(chǎn)品在糖基化分子結(jié)構(gòu)上完全一致［2－3］。相對(duì)于小分子藥物，現(xiàn)有科學(xué)研究對(duì)單抗等大分子蛋白藥物的分子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)知仍然存在局限。目前對(duì)大分子藥物之間的相似性評(píng)價(jià)方面往往需要綜合藥學(xué)、動(dòng)物和人體等試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)構(gòu)和質(zhì)量的相似性研究的深度和程度決定了開展人體臨床評(píng)估的必要性和程度。各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)鼓勵(lì)研發(fā)企業(yè)采用最新的分析技術(shù)手段對(duì)原研藥和生物類似藥的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，證明與原研藥的“相似性”。

蛋白糖基化是一種重要的翻譯后修飾，造成了蛋白藥物糖基化修飾分子結(jié)構(gòu)上的多樣性和異質(zhì)性。蛋白糖基化對(duì)蛋白的免疫原性和有效性有重要影響［4］，被普遍認(rèn)為是治療性蛋白藥物最重要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性( CQA) 之一。細(xì)胞基質(zhì)和生產(chǎn)工藝的變化都可能影響終產(chǎn)品蛋白的糖基化修飾的組成和結(jié)構(gòu)［5－6］。因此，研發(fā)單位需要對(duì)不同研發(fā)階段的蛋白藥物進(jìn)行全面深入的表征，保證生產(chǎn)工藝的一致性、產(chǎn)品的安全性、生物類似藥和原研藥的可比性。本文將以IgG 類單克隆抗體為例，介紹蛋白類藥物審評(píng)工作中糖基化結(jié)構(gòu)表征的重要性以及生物類似藥糖基化結(jié)構(gòu)表征的技術(shù)考慮。

1 、蛋白藥物的糖基化結(jié)構(gòu)和功能

蛋白糖基化修飾一般為寡糖結(jié)構(gòu)，多數(shù)單克隆抗體糖基化修飾為N-連接寡糖。IgG 型單克隆抗體在Fc 段的Asn-297 均有一個(gè)保守的N 糖基化位點(diǎn)，與Fc 段的免疫效應(yīng)功能密切相關(guān)。除Fc 糖基化外，約20%的IgG 在Fab 區(qū)域存在另一個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)，這2 個(gè)糖基化位點(diǎn)都位于重鏈上［7］。

除N-連接的糖基化外，極少數(shù)單克隆抗體藥物中也存在O-連接的糖基化。O-連接的糖基化是糖鏈和蛋白質(zhì)中的氨基酸( 絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸) 殘基中的氧原子的連接，其主要發(fā)生在真核生物的高爾基體上。由于O-連接的糖基化位點(diǎn)無保守序列且糖鏈無固定的核心結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜多變。本文主要以對(duì)單克隆抗體藥物最常見的N-連接糖基化為例進(jìn)行介紹。

N-連接寡糖一般具有“雙觸角/雙分枝”的五糖核心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由甘露糖( Man) 和N-乙酰葡糖胺( GlcNAc) 2 種己糖分子組成，不同糖型除核心結(jié)構(gòu)外還另外含有不同數(shù)目的糖分子，如巖藻糖( Fuc) 、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖( Gal) 、二等分N-乙酰葡糖胺和唾液酸( Sia) 。糖鏈的長度、分叉形式和單糖序列的變化導(dǎo)致了糖基化修飾的復(fù)雜性。根據(jù)不同的連接方式使得N-糖基化的五糖核心結(jié)構(gòu)分為高甘露糖型、雜合型和復(fù)雜型3 種類型( 圖1) 。與其他糖蛋白相比，多于2 個(gè)觸角/分枝的結(jié)構(gòu)在單抗分子中通常不多見，且唾液酸含量也較低［8］。

單抗的Fc 段與其受體FcRs 結(jié)合發(fā)揮抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用( antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC) 、激活C1q 發(fā)揮補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用( complement dependent cytotoxicity，CDC) ，與新生Fc 受體( neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn)結(jié)合介導(dǎo)清除作用，糖基化修飾通過影響Fc 段功能區(qū)的結(jié)合來調(diào)節(jié)ADCC，CDC 以及藥物半衰期［4］，無糖基化修飾的IgG 則由于缺失了與C1q 和FcRs 的結(jié)合能力而不能引發(fā)ADCC 和CDC 作用。Fab 段和Fc 段特定的糖基化修飾還會(huì)誘發(fā)免疫原性。已有研究證明，核心巖藻糖基化、末端半乳糖、唾液酸的含量可以顯著影響抗體Fc 段介導(dǎo)的效應(yīng)功能，進(jìn)而影響抗體藥物的療效、安全性和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)［9－10］。

2 、糖基化的生物學(xué)表征

如前所述，抗體結(jié)構(gòu)中的糖基化修飾基團(tuán)對(duì)抗體的功能有重要影響?？贵w結(jié)構(gòu)中糖基化基團(tuán)修飾類型和程度以及不同的翻譯后修飾水平造成了抗體糖基分子結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，其可以通過改變抗體構(gòu)象等方式，影響抗體的生物活性［11］。因此，對(duì)抗體相關(guān)的生物活性測定是糖基化修飾結(jié)果分析判別的方法之一，也是生物類似藥相似性評(píng)價(jià)的重要組成部分?；钚詼y定按方法原理不同可以分為2 類: ① 測定受體和靶蛋白的結(jié)合。② 測定受體/靶蛋白結(jié)合后的生物效應(yīng)。常見的測定抗體功能/活性的試驗(yàn)方法有無細(xì)胞參與的結(jié)合試驗(yàn)、有細(xì)胞介入的結(jié)合試驗(yàn)、細(xì)胞活性試驗(yàn)，這3 種方法就其技術(shù)上來講，雖然其穩(wěn)定性、靈敏度、重現(xiàn)性逐步降低，但相應(yīng)的對(duì)抗體體內(nèi)活性的預(yù)測和參考價(jià)值是逐漸遞增的，因此一般鼓勵(lì)研發(fā)單位建立細(xì)胞模型的生物活性測定方法。需要注意的是，由于抗體結(jié)構(gòu)上或試驗(yàn)細(xì)胞體系上的差異，同一種活性測定方法對(duì)同靶點(diǎn)的不同抗體藥物可能并不完全適用，需要在方法移植/轉(zhuǎn)移前進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。參照藥和生物類似藥的受體/靶蛋白結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)可能存在差異，生物類似藥的研發(fā)機(jī)構(gòu)在方法設(shè)計(jì)上應(yīng)全面考慮，不建議使用某一劑量下的活性數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)二者的相似/不相似，建議考察量效反應(yīng)的整體性特征。

另外，采用活性方法評(píng)價(jià)生物類似藥也有一定的局限性。生物活性測定方法本身靈敏度不高，不一定能夠發(fā)現(xiàn)生物類似藥和參照藥的區(qū)別; 活性方法建立在抗體藥物的作用機(jī)制的基礎(chǔ)之上，并不是每一種機(jī)制都適合用來開發(fā)生物活性方法。因此，僅靠活性方法并不能充分確定生物類似藥的相似性。研究單位通常在生物類似藥的開發(fā)過程中，采取系統(tǒng)靈敏的理化分析手段檢測產(chǎn)品之間糖基化修飾基團(tuán)和結(jié)構(gòu)上的差異，結(jié)合相關(guān)的活性方法一起進(jìn)行生物類似藥與參照藥的相似性評(píng)估，證明二者的糖基化單糖組成與含量、糖鏈結(jié)構(gòu)、相關(guān)活性的綜合相似性。

3、 糖基化修飾結(jié)構(gòu)的理化方法表征

蛋白糖基化中的寡糖為非模板合成，結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，糖基化結(jié)構(gòu)表征難度遠(yuǎn)超核酸和氨基酸序列表征。FDA，EMA 生物類似藥相關(guān)的指導(dǎo)原則都鼓勵(lì)研發(fā)單位采用最新的分析技術(shù)手段，對(duì)生物類似藥和原研藥的糖基化修飾位點(diǎn)、程度以及寡糖的組成進(jìn)行深入比較研究［12－13］。為制訂相似性評(píng)價(jià)的接受標(biāo)準(zhǔn)，研發(fā)單位應(yīng)采用足夠批次的參照藥與生物類似藥進(jìn)行比較研究。FDA 建議用于相似性評(píng)價(jià)的樣品批次一般不低于10 批，并盡可能覆蓋產(chǎn)品間的差異，如不同貨架期、不同規(guī)模的產(chǎn)品，參照藥的批次應(yīng)考慮納入歐、美不同產(chǎn)地來源等。

蛋白的糖基化修飾結(jié)構(gòu)分析可根據(jù)測試樣品分子量大小一般分3 個(gè)水平進(jìn)行，即完整蛋白( top) 和亞單位蛋白( middle-up) 、糖肽( bottom-up) 、游離寡糖。

3.1完整蛋白和亞單位水平

色譜、電泳和質(zhì)譜技術(shù)目前已經(jīng)廣泛用于完整蛋白水平的糖基化修飾分析，可以提供完整蛋白的分子量大小等信息。亞單位蛋白水平的分析通常采用化學(xué)還原單抗分子中的二硫鍵或者蛋白酶酶切等方法，通過制備分子量較小的亞單位，以便對(duì)單抗分子中的變異體進(jìn)行分離，提高質(zhì)譜的靈敏度。完整蛋白和亞單位的水平分析中常見技術(shù)包括RPLC-MS，CE /CIEF，MS ( MALDI或ESI) 和凝集素糖蛋白識(shí)別芯片等，一般均具有快速、方便、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于不同開發(fā)階段的生物類似藥和參比品主要糖型結(jié)構(gòu)的比較分析，還可以用于單抗重鏈之間寡糖的對(duì)稱性分析［14］。

完整蛋白和亞單位水平的分析并不能提供糖基化修飾結(jié)構(gòu)的精細(xì)信息。完整蛋白和亞單位的質(zhì)譜法測定容易受到蛋白同位素峰的影響，對(duì)單一同位素峰的靈敏度較低，只能提供抗體的平均分子量信息，即使高分辨率質(zhì)譜也不能獲得更多信息。因此，從完整蛋白和亞單位水平很難進(jìn)行精細(xì)的翻譯后修飾的檢測，也難以獲得準(zhǔn)確的糖型( 尤其是低豐度糖型) 及糖基化位點(diǎn)的相關(guān)信息。

3.2糖肽水平

糖肽水平的分析通常用胰酶等蛋白酶對(duì)完整蛋白進(jìn)行的酶解，產(chǎn)生分子量大約為0. 5 ～ 5 kDa 的小肽，采用色譜或電泳分離后再進(jìn)行MALDI-MS 或ESI-MS 分析。因?yàn)槠涮峁┑碾亩呜S富，可以提供氨基酸序列、糖基化、微小的化學(xué)和酶修飾等信息。糖肽水平的質(zhì)譜分析不僅可以提供糖基化位點(diǎn)信息，還可以借助串聯(lián)質(zhì)譜( MS /MS) 技術(shù)對(duì)糖肽序列、寡糖組成進(jìn)行解析。基于上述優(yōu)勢，以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的糖肽分析在抗體批次間一致性評(píng)估、生物類似藥和參照藥相似性評(píng)估方面已經(jīng)廣泛應(yīng)用。需要說明的是，糖肽水平的分析應(yīng)該歸屬于糖基化修飾的定性分析，鑒于單抗產(chǎn)品復(fù)雜的糖基化修飾，還需要進(jìn)一步借助寡糖的定量分析手段進(jìn)行表征。

3.3游離寡糖分析

游離寡糖的分析方法已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，企業(yè)界和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)都有大量的文獻(xiàn)報(bào)道［15－16］。通常采用酶法或化學(xué)試劑法使寡糖從完整蛋白中游離出來，以便進(jìn)一步對(duì)寡糖組成和含量進(jìn)行深入分析。對(duì)N-連接寡糖常用酰胺酶如肽N-糖苷酶F( PNGase F) ，其可定向切割N-乙酰葡糖胺( GlcNAc) 與蛋白結(jié)構(gòu)中的天冬酰胺的酰胺鍵，使寡糖脫離以便進(jìn)一步分析。如果蛋白結(jié)構(gòu)中含有N-連接和O-連接糖基化，通常采用肼解反應(yīng)或還原性β-消除反應(yīng)［17］。

對(duì)游離寡糖的分析通常有3 種方法: ① 配有脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜法( HPAECPAD)。② 直接質(zhì)譜分析( MS) 。③ 配有熒光檢測器或質(zhì)譜檢測器的高效毛細(xì)管電泳法( HPCE) 。寡糖結(jié)構(gòu)中無生色團(tuán)，常采用熒光試劑標(biāo)記后進(jìn)行光譜檢測，如毛細(xì)管電泳分析中N-寡糖的分析常使用激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)，使用8-氨基-萘-1，3，6-三磺酸( APTS) 作為標(biāo)記物。親水相互作用色譜( HILIC)使用2-氨基苯甲酰胺( 2-AB) 或2-氨基苯甲酸( 2-AA) 對(duì)寡糖進(jìn)行標(biāo)記［18－19］。質(zhì)譜法雖然可以直接對(duì)寡糖進(jìn)行檢測，但采用化學(xué)標(biāo)記后進(jìn)行質(zhì)譜檢測能極大提高離子化效率，并可提供更多的片段結(jié)構(gòu)信息［20］。因此，借助色譜-光譜/質(zhì)譜技術(shù)，可以對(duì)寡糖進(jìn)行定性和定量分析。

4 、生物類似藥開發(fā)和評(píng)價(jià)中關(guān)于糖基化修飾的一般考慮

糖基化修飾對(duì)單抗藥物的療效、穩(wěn)定性、免疫原性、藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)等具有重要影響，因此一般情況下糖基化修飾被認(rèn)為是單抗藥物的一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性( CQA) 。研發(fā)人員可以根據(jù)抗體的作用機(jī)制，針對(duì)性的優(yōu)化抗體分子中糖基化結(jié)構(gòu)和水平，如采用敲除巖藻糖方式以提高其ADCC 活性等，以達(dá)到開發(fā)更優(yōu)的有效性、安全性或改善藥動(dòng)學(xué)等目的。此時(shí)除了對(duì)單抗產(chǎn)品的糖型進(jìn)行全面表征外，研發(fā)單位應(yīng)根據(jù)抗體的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)合適的理化和活性評(píng)價(jià)方法，對(duì)其特異的糖基化修飾結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)量控制; 動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注分子優(yōu)化設(shè)計(jì)的有效性、安全性以及對(duì)藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)( PK/PD) 的影響。

單抗藥物的糖基化修飾具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和組成，常見的單抗產(chǎn)品N-糖型主要為G0F，G1F，G2F，M5 等的混合組成，部分糖型如OligoMan 占比較高則可能會(huì)影響免疫原性或半衰期。生物類似藥的研發(fā)單位應(yīng)該對(duì)參比品的糖基化修飾信息進(jìn)行充分調(diào)研，通過合理的理化分析、體內(nèi)外試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)擬開發(fā)藥物與參比品的相似性程度。質(zhì)量研究過程中注意對(duì)單抗藥物的糖基化結(jié)構(gòu)表征應(yīng)全面，綜合運(yùn)用活性和理化表征手段，理化表征由點(diǎn)及面，通過完整蛋白和亞單位蛋白、糖肽、游離寡糖水平的分析，全面反映糖基化修飾的位點(diǎn)、寡糖種類、結(jié)構(gòu)以及豐度?？紤]到大分子藥物及糖基化基團(tuán)修飾的復(fù)雜性，監(jiān)管機(jī)構(gòu)鼓勵(lì)研發(fā)單位采用最新的技術(shù)手段對(duì)抗體糖基化結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。鑒于理化表征的靈敏度一般高于體外活性和體內(nèi)試驗(yàn)，對(duì)糖型理化分析后得出的差異應(yīng)合理評(píng)估。FDA 生物類似藥相關(guān)指導(dǎo)原則中關(guān)于質(zhì)量研究的相似性評(píng)價(jià)一般得出不夠相似( insufficient analytical similarity) 、未確定性相似( analytical similarity with residual uncertainty) 、實(shí)驗(yàn)性相似( tentative analytical similarity) 、指紋相似( fingerprint-like analytical similarity) 4 個(gè)結(jié)論，對(duì)未確定性相似的說明中以糖基化結(jié)構(gòu)特征為例，建議理化分析后存在的不確定性，可以通過PK/PD 研究進(jìn)一步評(píng)價(jià)，以此來確定理化分析后糖型相關(guān)參數(shù)的相似性可接受范圍［22］。

單抗產(chǎn)品的糖基化修飾主要受宿主細(xì)胞酶催化機(jī)制、高爾基體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、環(huán)境因素和所能獲得糖核苷酸影響。多因素相互作用使得各生產(chǎn)批次糖型很難完全相同，即使同一制造商使用相同的設(shè)備和工藝過程。單抗藥物研發(fā)單位在產(chǎn)品的臨床前及臨床研究階段，需要進(jìn)行持續(xù)的糖基化修飾特征的監(jiān)測和控制，對(duì)產(chǎn)品批次間差異的可接受范圍進(jìn)行限定，不斷積累數(shù)據(jù)和控制經(jīng)驗(yàn)，以確保上市產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。一些先進(jìn)的生物制藥企業(yè)已經(jīng)率先將質(zhì)量源于設(shè)計(jì)( QbD) 理念用于單抗藥物的開發(fā)，通過對(duì)糖基化修飾等關(guān)鍵質(zhì)量屬性的深入分析，設(shè)計(jì)合理的工藝參數(shù)空間，進(jìn)一步達(dá)到了產(chǎn)品質(zhì)量靠生產(chǎn)過程的嚴(yán)格控制而非依靠檢驗(yàn)的目的。建議生物類似藥的研發(fā)企業(yè)通過對(duì)多批次參照藥的糖型分析、體外活性測定、非臨床和臨床試驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，在生物類似藥開發(fā)過程中不斷積累數(shù)據(jù)，運(yùn)用多變量分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)手段，設(shè)計(jì)與參照藥相似性相關(guān)的多參數(shù)操作空間，進(jìn)而建立相似性評(píng)價(jià)的工藝與質(zhì)量可接受標(biāo)準(zhǔn)。

5 、結(jié)語

蛋白的糖基化是一種重要的翻譯后修飾，糖基化蛋白中的寡糖為非模板合成，并呈復(fù)雜的樹枝狀結(jié)構(gòu)，據(jù)報(bào)道僅由6 種單糖組成的寡糖鏈，其理論結(jié)構(gòu)即達(dá)到驚人的1 012 種［21］。宿主細(xì)胞、生產(chǎn)工藝等各種影響因素更增加了糖基化修飾結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。審評(píng)中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)不同申報(bào)廠家的生物類似藥單抗產(chǎn)品其糖基化修飾存在明顯差異。即使歐美已獲批上市的生物類似藥與參照藥、生物類似藥批次之間的糖基化修飾結(jié)構(gòu)差異亦有報(bào)道。Giorgetti 等［23］采用CZE-ESI-MS 技術(shù)評(píng)價(jià)了Remicade 與其類似藥Remsima /Inflectra 的糖基化修飾，發(fā)現(xiàn)了二者糖型中8 種N-寡糖的相對(duì)豐度存在明顯差異，Pisupati等［24］采用LC-MS /MS 技術(shù)進(jìn)行測定也得出了類似的結(jié)論。生物類似藥糖基化修飾基團(tuán)結(jié)構(gòu)上的差異對(duì)產(chǎn)品的有效性、安全性的影響程度需要結(jié)合藥物作用機(jī)制以及藥效、毒理和臨床數(shù)據(jù)綜合評(píng)估。從質(zhì)量研究角度闡明這些差異，在動(dòng)物及人體試驗(yàn)中針對(duì)性的觀察糖基化修飾基團(tuán)結(jié)構(gòu)上的差異可能的影響，對(duì)于評(píng)價(jià)其相似性并支持產(chǎn)品最終上市有重要意義。