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1、 概述

用于各種藥物劑型的活性藥物成分（API）需要達(dá)到一定的純度要求，符合相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；工藝研發(fā)流程中的中間體亦需要具有一定純度，嚴(yán)格控制影響下一步反應(yīng)或者影響下一步目標(biāo)產(chǎn)物或終產(chǎn)品純化的雜質(zhì)的含量（impurity or purity）。在長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以及API強(qiáng)制降解試驗(yàn)中，分析方法不僅需要能夠?qū)PI原有組分做到有效分離，對(duì)于實(shí)驗(yàn)處理后樣品同樣需要具有有效分離各組分的能力亦即impurity indicating（stability indicating）。

兩種分析方法一般選擇HPLC進(jìn)行開發(fā)，impurity分析方法要求API中已有雜質(zhì)做到有效分離（Resolution> 1.5），主成分的色譜峰峰形對(duì)稱；stability indicating分析方法除此之外，與之最大不同在于，能夠?qū)Ω鞣N條件（長期穩(wěn)定性，加速穩(wěn)定性，強(qiáng)制降解以及制劑過程中）下可能產(chǎn)生的相關(guān)雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分離，其開發(fā)難點(diǎn)在于各種條件下所產(chǎn)生的impurity profile有所不同，從而導(dǎo)致在分析方法開發(fā)的時(shí)候，可能出現(xiàn)顧此失彼的狀況。

Figure 1 impurity or purity方法典型圖譜

Figure 2 stability indicating方法典型圖譜

2、Impurity or purity

Impurity or purity方法區(qū)別與IPC方法，前者分析樣品純度較高，有關(guān)雜質(zhì)極性與保留能力分布范圍較窄，相應(yīng)的對(duì)于色譜柱以及流動(dòng)相選擇特異性比較強(qiáng)，對(duì)梯度斜率變化不十分敏感，分析方法運(yùn)行時(shí)間一般比后者短。

2.1 Isocratic or gradient

對(duì)于純度檢測，HPLC操作模式可選isocratic或者gradient模式（其他操作條件一致情況下，isocratic模式下，檢測器響應(yīng)值要比gradient模式小，達(dá)到同等檢測限，isocratic模式需要的樣品濃度較大），兩種模式的選擇需要根據(jù)分析方法運(yùn)行總時(shí)間，有關(guān)雜質(zhì)與主成分極性，保留能力相關(guān)性綜合考慮。

無論isocratic還是gradient模式，均需要優(yōu)先對(duì)容量因子K進(jìn)行選擇，以合適的色譜峰寬作為標(biāo)準(zhǔn)，K優(yōu)先控制在5-10為宜（方法運(yùn)行時(shí)間可控，樣品濃度不至于太大，以免對(duì)于一些化合物出現(xiàn)樣品超載，導(dǎo)致色譜峰形變異或方法線性范圍較窄的情形發(fā)生）。方法開發(fā)時(shí)，對(duì)于K的控制，可以先選定一個(gè)有機(jī)相比例以及固定梯度斜率，得到起始的容量因子K1，之后依據(jù)Snyder規(guī)則（lgK= lgKw - Sψ）調(diào)整起始有機(jī)相比例得到容量因子K2（5-10），之后再根據(jù)樣品的impurity profile調(diào)整梯度斜率，使各雜質(zhì)分離度達(dá)到相關(guān)要求并再次微調(diào)有機(jī)相起始比例即可，如需進(jìn)一步優(yōu)化，可以漸近法循環(huán)調(diào)整。

Figure 3 容量因子K調(diào)整流程

2.2 色譜柱

一般地，對(duì)于非有機(jī)酸/堿類樣品，全多孔硅膠基質(zhì)/有機(jī)與無機(jī)雜化基質(zhì)，封端（避免裸露硅羥基引起色譜峰拖尾）C8色譜柱以及C18色譜柱即可滿足需求；對(duì)于有機(jī)酸/堿類樣品，C8，C18色譜柱一般不存在容量因子K的問題，問題在于樣品的載樣量以及色譜峰的峰形一般較差（拖尾）；Shield RP色譜柱作為極性基團(tuán)內(nèi)嵌色譜柱，雖然能夠一定程度上改善色譜峰的峰形（如圖4a，圖4b），但與RP色譜柱的內(nèi)嵌極性基團(tuán)是什么以及樣品呈現(xiàn)酸（堿）性有關(guān)。

Figure 4a Shield RP色譜柱對(duì)拖尾因子的改善作用

Figure 4b Shield RP色譜柱對(duì)拖尾因子的改善作用

縱然可以通過增加有機(jī)相的起始比例（對(duì)于Gradient）以及增大梯度斜率的方式，減小拖尾因子，但是樣品的載樣量依然沒有得到改善，且容量因子會(huì)變小，方法對(duì)于雜質(zhì)的分辨能力也隨之降低。

能夠同時(shí)增加樣品載樣量以及改善色譜峰峰形的有效方法是使用離液離子（氯化銨、磷酸鹽、硼酸鹽等）并調(diào)節(jié)pH，或者使用離子對(duì)試劑（在使用該方法時(shí)，需要注意色譜柱需要使用全封端色譜柱盡可能避免使用gradient模式）。

2.3 流動(dòng)相

有機(jī)相一般選擇背景吸收弱的試劑，乙腈與甲醇二者極性差別只有0.6，而前者則可作為氫鍵的受體，后者則可作為氫鍵的給體，二者在選擇性上具有較強(qiáng)的互補(bǔ)作用，但甲醇相比乙腈，黏度較大造成系統(tǒng)背壓較高。

流動(dòng)相添加劑大致有五類可供選擇：酸性添加劑，堿性添加劑，離液離子，緩沖鹽以及離子對(duì)添加劑。以減小背景吸收，降低檢測限作為出發(fā)點(diǎn)的話，酸性添加劑優(yōu)先選擇磷酸以及鹽酸（截止吸收≤195 nm）；以與MSD兼容角度出發(fā)，優(yōu)先選擇TFA以及FA（截止吸收210 nm左右）。堿性添加劑一般選擇氨水、二乙基銨或三乙基銨；離液離子一般選擇氯化銨、磷酸鹽、硼酸鹽等；緩沖鹽一般選擇甲酸銨與乙酸銨；離子對(duì)試劑一般選擇己烷磺酸鈉鹽、庚烷磺酸鈉鹽，十二烷基硫酸鈉鹽以及季銨鹽等。值得注意的是在使用緩沖鹽以及離子對(duì)試劑的時(shí)候，需要注意其純度，需是HPLC級(jí)別，否則在有機(jī)相比例線性增加的時(shí)候，會(huì)有過多未知干擾峰出現(xiàn)（在使用離子對(duì)試劑的時(shí)候，盡量使用Isocratic模式，避免使用Gradient模式）。

2.4 拖尾因子

導(dǎo)致色譜峰拖尾的原因比較多，大致有：溶劑效應(yīng)會(huì)引起色譜峰拖尾，色譜柱柱效下降引起色譜峰拖尾，流動(dòng)相以及pH不合適引起色譜峰拖尾等。一般地，容量因子K在5-10的范圍內(nèi)的色譜峰拖尾，可排除溶劑效應(yīng)的原因，如果新色譜柱亦拖尾，則大多是由于流動(dòng)相以及pH選擇不合適，未能有效避開樣品pKa±2的區(qū)間。此時(shí)，需要對(duì)流動(dòng)相的pH做出調(diào)整。

此外，需要區(qū)分真的拖尾以及未知雜質(zhì)峰壓在主峰尾巴上的情況，一般地，非酸/堿性樣品，不大會(huì)出現(xiàn)色譜峰拖尾較大的情況。此時(shí)可對(duì)峰純度進(jìn)行檢測，對(duì)比多種吸收波長下的色譜峰形狀或通過進(jìn)一步降低梯度斜率以及與MSD聯(lián)用，做出判斷。

3 、Stability indicating or impurity indicating

Stability indicating（impurity indicating）方法與impurity（purity）方法的最大區(qū)別在于前者不僅要求對(duì)已然存在的組分能夠有效分離，而且要求能夠?qū)Χ喾N條件下可能產(chǎn)生的雜質(zhì)與已有組分做到有效保留并分離。這就要求分析方法的有效色譜峰容量（Res.>1.5）盡可能大，需要對(duì)樣品的分子結(jié)構(gòu)具有足夠的了解，如下圖分子結(jié)構(gòu)（圖5a，圖5b，圖5c）。

Figure 5a 兩性化合物

Figure 5b 堿性化合物

Figure 5c 酸性化合物

如上圖5a所示分子結(jié)構(gòu)為一兩性化合物，圖5b所示分子結(jié)構(gòu)為一堿性化合物，圖5c所示分子結(jié)構(gòu)為一酸性化合物。在各種實(shí)驗(yàn)條件下，圖5a結(jié)構(gòu)酰胺鍵可能發(fā)生水解，形成一個(gè)含有兩羧基的兩性化合物片段以及一個(gè)含有兩個(gè)二級(jí)胺的兩性化合物片段（圖5b以及圖5c所示分子結(jié)構(gòu)類似，均可能有極性更大的片段分子產(chǎn)生），二者的保留均會(huì)前移，甚至可能保留不住。

如上述討論情況，就需要對(duì)樣品的分子結(jié)構(gòu)具有一定的了解，在方法開發(fā)之初，就預(yù)留出足夠的色譜峰容量，對(duì)各種實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生的相關(guān)雜質(zhì)盡可能做到有效保留。

4、 結(jié)論

Impurity（purity）方法的目的是對(duì)生產(chǎn)的中間體以及終產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，而Stability indicating（impurity indicating）方法則是對(duì)各種實(shí)驗(yàn)條件以及長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行檢測，其產(chǎn)生的impurity profile直接反應(yīng)化合物的穩(wěn)定性，其數(shù)據(jù)可以直接用于后期制劑研發(fā)過程。