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嘉峪檢測網(wǎng) 2021-03-15 09:56
為確保產(chǎn)品安全性和功效，蛋白質(zhì)治療制劑必須在制造之后以及指定的保質(zhì)期結(jié)束時，還能夠達到所規(guī)定的質(zhì)量特征。許多物理和化學(xué)因素會影響生物制藥產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性，尤其是生物制劑長期保存在密閉的容器系統(tǒng)中之后，溫度，光線以及運輸和處理過程中的攪動可能會使得生物制劑發(fā)生變化。與傳統(tǒng)化學(xué)藥物相比，蛋白質(zhì)是具有比較復(fù)雜的物理化學(xué)特征和較大的分子實體，從其一級氨基酸序列到高級的二級和三級結(jié)構(gòu)，在某些情況下還包括諸如亞基締合等四級元素。
許多蛋白質(zhì)被糖基化，一些蛋白質(zhì)具有其他形式的翻譯后修飾，例如磷酸化，這也是影響其潛在的降解途徑以及其降解動力學(xué)的相關(guān)因素。蛋白質(zhì)通常對溶液化學(xué)性質(zhì)的微小變化比較敏感。它們僅在相對較窄的pH和滲透壓范圍內(nèi)保持成分和構(gòu)象的穩(wěn)定，而且許多溶液還需要額外的支持性制劑成分才能使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的保留在溶液中，特別是隨著時間的流逝，即使是凍干蛋白質(zhì)產(chǎn)品也會發(fā)生降解。
分析化學(xué)的進步已經(jīng)確定了隨著時間的流逝，重組蛋白治療產(chǎn)品中可能發(fā)生許多降解途徑。這些途徑產(chǎn)生化學(xué)或物理不穩(wěn)定性?；瘜W(xué)不穩(wěn)定性是指多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)共價鍵的形成或破壞。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾包括氧化、脫酰胺、還原和水解。
而蛋白質(zhì)的展開、解離、變性、聚集和沉淀被稱為構(gòu)象或物理不穩(wěn)定性。在某些情況下，蛋白質(zhì)降解途徑具有協(xié)同作用：化學(xué)事件可能觸發(fā)物理事件，例如在氧化之后發(fā)生聚集。
在這里，我們介紹了幾種蛋白質(zhì)降解途徑：氧化、光降解、二硫鍵變化、脫酰胺、聚集、沉淀、解離和斷裂。我們舉例說明了每種的生物化學(xué)特征，顯示了誘導(dǎo)變化的潛在手段并提出了預(yù)防方面的制劑注意事項。并且以檢測方法和驗證穩(wěn)定性指示方法的策略作為結(jié)尾。我們的目標是為蛋白質(zhì)產(chǎn)品的主要降解途徑提供簡介（或復(fù)習(xí)），并為每種途徑提供參考。我們鼓勵各位“藥時空”讀者查閱這些參考文獻，以獲取每種途徑的基本生物化學(xué)的擴展詳細信息，描述特定蛋白質(zhì)實驗的案例研究以及有關(guān)制劑開發(fā)策略的更多信息。
氧化、光降解和二硫化物變化
某些氨基酸與環(huán)境中存在的氧自由基的反應(yīng)，蛋白質(zhì)和多肽容易受到氧化損傷。蛋氨酸、半胱氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸最易被氧化：Met和Cys因其具有硫原子而His、Trp和Tyr因其芳環(huán)而受到氧化。氧化可改變蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性（例如折疊和亞基締合）并導(dǎo)致聚集或斷裂。根據(jù)蛋白質(zhì)中氧化氨基酸相對于其功能性或表位樣結(jié)構(gòu)域的位置，它也可能對效價和免疫原性產(chǎn)生潛在的負面影響。
例如，甲狀旁腺激素生物活性差異影響通過任一的Met-8或Met-18和雙氧化的單氧化（MET-8為Met-18）當每個物種中分離，并使用在檢測體外生物測定法。同樣，源自大腸桿菌的人干細胞因子（huSCF）中Met-36和Met-48的氧化分別將其效價降低40％和60％，同時將SCF二聚體的解離速率常數(shù)提高了2到3倍，表明對亞基結(jié)合和三級結(jié)構(gòu)有影響。在其他情況下，即使看到實質(zhì)性的結(jié)構(gòu)變化，氧化對蛋白質(zhì)效能也沒有可測量的影響。例如，干擾素α-2b中的氧化Met-111影響了分子的一級，二級和三級結(jié)構(gòu)，并通過單克隆抗體（MAb）阻止了位點特異性表位的識別，而沒有改變體外生物學(xué)活性。
涉及的機理和因素：下圖1顯示了蛋氨酸和半胱氨酸殘基氧化的生化途徑。蛋氨酸在溶液中被大氣中的氧氣和氧自由基氧化，形成蛋氨酸亞砜和蛋氨酸砜。這兩種都比未氧化的蛋氨酸更大且極性更大，這可以改變蛋白質(zhì)的折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在堿性pH下，過氧化氫可提高重組人甲狀旁腺激素（rHu-PTH）中蛋氨酸的氧化率。
圖1 蛋氨酸和半胱氨酸殘基氧化的生化途徑
半胱氨酸的氧化在堿性pH值上也更為普遍，使巰基去質(zhì)子化。半胱氨酸的氧化在還原性環(huán)境中誘導(dǎo)二硫鍵斷裂（圖1，下圖）。在這樣的環(huán)境中，半胱氨酸氧化涉及硫醇鹽離子對二硫鍵的親核攻擊，產(chǎn)生新的二硫鍵和不同的硫醇鹽離子。然后，新的硫醇鹽可以與另一個二硫鍵反應(yīng)形成半胱氨酸。
這種由蛋白質(zhì)降解形成的分子間二硫鍵會累積錯配的二硫鍵和混亂的二硫鍵，從而改變蛋白質(zhì)構(gòu)象和亞基締合。
在金屬離子或附近的巰基存在下，半胱氨酸殘基也可能自發(fā)氧化形成分子副產(chǎn)物亞磺酸和半胱氨酸。例如，人類成纖維細胞生長因子（FGF-1）表現(xiàn)出銅催化的氧化作用，可產(chǎn)生同型二聚體。
蛋白質(zhì)中巰基的空間取向在半胱氨酸氧化中起重要作用。氧化速率與那些硫醇基團之間的距離成反比。與堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）一樣，這最終可能導(dǎo)致形成大的低聚物或非功能性單體，而堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）包含三個易被氧化并形成分子間或分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸。
這種氧化作用通常會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象修飾，因為半胱氨酸二硫鍵增加了蛋白質(zhì)內(nèi)部的側(cè)鏈體積，并導(dǎo)致不利的范德華相互作用，從而維持了原始結(jié)構(gòu)。
組氨酸殘基通過與咪唑環(huán)的反應(yīng)對氧化高度敏感，隨后可生成其他羥基。氧化組氨酸可以在光源和/或金屬氧化（產(chǎn)生天冬酰胺/天冬氨酸和2-氧代-組氨酸（2-O-His）的作為降解產(chǎn)物。它可能是一個短暫的部分，因為它可以觸發(fā)蛋白質(zhì)聚集和沉淀，從而使2-O-His的分離（作為單獨的降解物）變得難以理解。酪氨酸的氧化可通過形成酪氨酸而導(dǎo)致共價聚集?？臻g因素也可能影響酪氨酸和組氨酸的氧化。相鄰的帶負電荷的氨基酸加速酪氨酸氧化，因為它們具有對金屬離子的高親和力，而帶正電荷的氨基酸殘基不利于反應(yīng)。如果相鄰氨基酸很大，則可能會掩蓋相鄰氨基酸的氧化并阻止其被氧化。已經(jīng)觀察到，以序列存在的組氨酸顯著增加了肽的氧化速率和甲硫氨酸亞砜的產(chǎn)生。咪唑環(huán)在組氨酸側(cè)鏈上的強金屬結(jié)合親和力使氧化物質(zhì)靠近底物蛋氨酸。
光降解：光氧化會改變蛋白質(zhì)的一級，二級和三級結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致長期穩(wěn)定性，生物活性或免疫原性方面的差異。暴露于光線下會觸發(fā)一系列生化事件，即使關(guān)閉光源后，這些生化變化也會繼續(xù)影響蛋白質(zhì)。這些作用取決于賦予蛋白質(zhì)的能量和環(huán)境氧氣的存在。當化合物吸收一定波長的光時，就會引發(fā)光氧化作用，從而提供能量將分子提升到激發(fā)態(tài)。被激發(fā)的分子然后可以將該能量轉(zhuǎn)移到分子氧，將其轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性單線態(tài)氧原子。這就是在存在O的情況下可以在光下修飾色氨酸，組氨酸和酪氨酸的方法。酪氨酸光氧化可產(chǎn)生單，二，三和四羥基酪氨酸作為副產(chǎn)物。由于氧化的酪氨酸殘基之間的交聯(lián)，在某些蛋白質(zhì)中觀察到聚集。光氧化反應(yīng)主要是位點特異性的。例如，在用強光處理的人類生長激素中，氧化主要在組氨酸處進行。另外，肽主鏈也是光降解的靶標?；蛘?，通電的蛋白質(zhì)本身可以以光敏方式直接與另一個蛋白質(zhì)分子反應(yīng)，通常是在低pH值下通過蛋氨酸和色氨酸殘基。
賦形劑和可浸出物可以協(xié)同影響蛋白質(zhì)的氧化（并因此降解）。
在某些情況下，配方成分會影響光氧化速率：例如，磷酸鹽緩沖液比其他緩沖液系統(tǒng)更能促進蛋氨酸的降解速率。金屬離子催化的氧化取決于環(huán)境中金屬離子的濃度。Fe3+，Ca2+，Cu2+，Mg2+或Zn2+的0.15-ppm氯化物鹽的存在不會影響人胰島素樣生長因子的氧化速率，但是當金屬濃度增加到1ppm，觀察到氧化顯著增加。在還原劑（例如抗壞血酸鹽）的存在下，氧化作用可能會加劇。抗壞血酸增加了人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的氧化。同樣，溶液中變性/解折疊試劑的存在會增加蛋白質(zhì)氧化的程度。穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所涉及的賦形劑（例如多元醇和糖）可以降低氧化速率。
氧化修飾取決于內(nèi)在的結(jié)構(gòu)特征，例如被掩埋和暴露的氨基酸。在人類生長激素的情況下，Met-14和Met-125容易被H2O2氧化，因為它們暴露于蛋白質(zhì)表面，而處于隱蔽位置的Met-170只有在分子被氧化時才能被氧化。展開。同樣，大氣中的氧氣會隨著時間的流逝引起蛋白質(zhì)氧化。頂空氧在結(jié)核菌素純化蛋白（TPP）的多劑量小瓶中導(dǎo)致四個月內(nèi)50％的效力喪失。
在蛋白質(zhì)加工和存儲過程中，通常由用作藥用賦形劑的聚山梨酯和聚乙二醇（PEG）引起的過氧化物污染可導(dǎo)致氧化。已經(jīng)觀察到Tween-80中過氧化物的含量與rhG-CSF中的氧化程度之間存在相關(guān)性，并且過氧化物誘導(dǎo)的氧化似乎比來自大氣氧的氧化更嚴重。過氧化物也可以從在初級包裝容器封閉系統(tǒng)中使用的塑料或彈性體材料，包括預(yù)充式注射器。
預(yù)防措施：盡量減少氧化降解的一種分子工程策略是，如果蛋白質(zhì)的性質(zhì)允許，用耐氧氨基酸代替對氧不穩(wěn)定的氨基酸。在治療性干擾素β（IFN-β）中，第17位的半胱氨酸被絲氨酸取代，因為前者在儲存過程中失去了抗病毒活性，導(dǎo)致氧化和二硫鍵爭奪。用非天然存在的正亮氨酸替代表皮生長因子（EGF）的蛋氨酸也可以防止氧化降解。
在某些情況下，通過脫氣去除頂空氧氣可能對防止氧化有效。填充步驟在氮氣壓力下進行，并且小瓶頂部空間氧氣置換成惰性氣體，如氮氣，以防止氧化。對于某些對氧化敏感的蛋白質(zhì)，在惰性氣體（例如氮氣或氬氣）的存在下進行處理。對于多劑量藥物制劑，使用頂空量可忽略不計的藥筒可克服氧化作用和相關(guān)后果。
在考慮更改容器密閉性時，必須格外小心。蛋白質(zhì)治療劑的許多此類更改（例如，從藥瓶到預(yù)裝注射器或從預(yù)裝注射器到筆式設(shè)備）被認為可以提高患者的便利性和易用性。但是，當相同的材料與蛋白質(zhì)基產(chǎn)品一起使用時，應(yīng)重新評估僅基于化學(xué)藥品的容器密閉系統(tǒng)的歷史經(jīng)驗，因為這可能會對蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生意想不到的獨特影響。
控制或增強諸如pH，溫度，曝光量和緩沖液成分之類的因素，也可以通過影響蛋白質(zhì)的環(huán)境來減輕氧化作用。半胱氨酸的氧化通?？梢酝ㄟ^維持蛋白質(zhì)制劑的正確氧化還原電位來控制，例如添加硫氧還蛋白和谷胱甘肽。抗氧化劑和金屬螯合劑也可用于防止蛋白質(zhì)制劑中的氧化。抗氧化劑是化學(xué)“犧牲目標”，具有強烈的氧化趨勢，會消耗促進氧化的化學(xué)物質(zhì)。為此，在生物治療制劑中使用了諸如L-蛋氨酸和抗壞血酸等清除劑。在沒有金屬離子的情況下，半胱氨酸作為一種游離氨基酸可以作為有效的抗氧化劑。作為螯合劑，EDTA和檸檬酸鹽可能與過渡金屬離子形成絡(luò)合物，并抑制金屬催化的位點特異性氧化。由于糖和多元醇與金屬離子的絡(luò)合，因此添加糖和多元醇還可以防止金屬催化的氧化。用人松弛素觀察到了葡萄糖，甘露醇，甘油和乙二醇對金屬催化氧化的保護作用。使用初級或次級包裝系統(tǒng)進行物理防護以免受紫外線/白光照射，可能需要保護光不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)免受光氧化。
脫酰胺
對于許多重組蛋白，可通過谷氨酰胺和天冬酰胺殘基的非酶脫酰胺作用觀察到肽和蛋白結(jié)構(gòu)的變化。這可能對他們的生理化學(xué)和功能穩(wěn)定性。已經(jīng)觀察到hGH的脫酰胺改變了人類生長激素的蛋白水解裂解。據(jù)報道，IFN-β的脫酰胺作用增加了其生物活性。已確定，與天然肽相比，導(dǎo)致天冬氨酰和異天冬氨酰形式的肽生長激素釋放因子的脫酰胺作用分別降低了25倍和500倍的生物活性。血紅蛋白中Asn-Gly位點的脫酰胺作用改變了其對氧氣的親和力。天冬酰胺的去酰胺化干擾了II類主要組織相容性復(fù)合物分子上的抗原呈遞。據(jù)報道，人表皮生長因子中Asp 11的異構(gòu)化導(dǎo)致其促有絲分裂活性降低了五倍。磷酸三糖磷酸異構(gòu)酶中兩個Asn-Gly序列的脫酰胺作用導(dǎo)致亞基解離。
涉及的機理和因素：脫酰胺作用是一種化學(xué)反應(yīng)，其中酰胺官能團從氨基酸上去除。后果包括蛋白質(zhì)的異構(gòu)化，外消旋化和截短化。下圖2顯示了脫酰胺降解天冬酰胺的機理。
圖2 顯示了脫酰胺降解天冬酰胺的機理。
異構(gòu)化：天冬氨酸到異天冬氨酸殘基的異構(gòu)化中的蛋白質(zhì)溶液是非酶脫酰胺（最通常觀察到的結(jié)果。
外消旋化：天冬酰胺脫酰胺過程中形成的琥珀酰亞胺的中間體是非常容易產(chǎn)生外消旋化，并轉(zhuǎn)換為d-天冬酰胺殘基。在堿性pH下觀察到除甘氨酸以外的其他氨基酸的外消旋化作用。
截短：在低pH值下，肽和蛋白質(zhì)的天冬酰胺側(cè)鏈上的酰胺基團發(fā)生去質(zhì)子化反應(yīng)，然后酰胺酶的氮原子對天冬酰胺殘基的肽羰基碳進行親核攻擊。這通過形成琥珀酰亞胺肽片段而產(chǎn)生肽鏈切割。琥珀酰亞胺環(huán)的隨后水解可產(chǎn)生天冬酰胺基和β-天冬酰胺基肽。
天冬氨酸-異天冬氨酸脫酰胺和異構(gòu)化反應(yīng)的機理相似，因為它們都通過分子內(nèi)環(huán)狀酰亞胺中間體進行。各個酰胺殘基的脫酰胺速率取決于其一級序列和三維（3D）結(jié)構(gòu)以及溶液性質(zhì)，例如pH，溫度，離子強度和緩沖離子（45）。谷氨酰胺殘基脫酰胺率通常比天冬酰胺殘基少。
如果pH> 5.0，則通過非常不穩(wěn)定的環(huán)狀酰亞胺中間體形成而發(fā)生脫酰胺作用，該中間體會自發(fā)進行水解。在強酸性條件下（pH 1-2），酰胺側(cè)鏈的直接水解比形成環(huán)酰亞胺更有利。肽鍵裂解在酰胺直接水解中更大程度地發(fā)生。在中性pH下，脫酰胺作用可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)異構(gòu)化。
脫酰胺作用的速率也受蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。螺旋結(jié)構(gòu)的增加會降低某些蛋白質(zhì)的脫酰胺速率。考察了幾種生長激素釋放因子類似物中的脫酰胺速率與甲醇誘導(dǎo)的α-螺旋結(jié)構(gòu)的關(guān)系。甲醇的添加增加了α-螺旋的水平，降低了脫酰胺的速率。在其天然結(jié)構(gòu)中，RNAase可以抵抗脫酰胺作用，這可能是因為環(huán)中相對剛性的骨架被Cys-8和Cys-12之間的二硫鍵以及殘基66-68處的β-轉(zhuǎn)角穩(wěn)定，這可能會阻止環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成。但是，如果將其還原和變性，則會重新折疊，生成天冬氨酸和異天冬氨酸形式，表明具有不同的酶促活性。用Iso-Asp-67替代Asp-67表明，異天冬氨酸形式的重折疊速度是完全酰胺化形式的一半。
在某些生物緩沖液存在下，儲存溫度會影響蛋白質(zhì)的脫酰胺速度。因為胺緩沖劑（例如Tris和組氨酸）具有較高的溫度系數(shù)，所以在與制備溫度不同的溫度下儲存可能會改變制劑的pH值。脫酰胺和異構(gòu)化反應(yīng)是pH敏感的過程，因此配方pH的那些變化可能會改變脫酰胺的速率。溫度的另一個間接影響是水的解離常數(shù)：水的氫氧根離子濃度可以隨溫度變化而變化，從而影響脫酰胺速率。
預(yù)防措施：溶液的pH值會嚴重影響脫酰胺作用。pH值為3-5的制劑可最大程度地減少肽脫酰胺作用。胰島素的AsnA-21和AsnB-3根據(jù)溶液的pH值形成異天冬氨酸或天冬氨酸。胰島素在Asn A-21的低pH溶液中迅速脫氨基。立體位阻也會影響脫酰胺反應(yīng)的速度：天冬酰胺后的大量殘基可能會抑制脫酰胺反應(yīng)中琥珀酰亞胺中間體的形成。用更龐大的亮氨酸或脯氨酸殘基代替甘氨酸殘基會導(dǎo)致該比率降低30到50倍。在凍干的制劑中，脫酰胺率通常降低，這可能是由于可以在其中發(fā)生反應(yīng)的游離水的可用性有限所致。
包含有機助溶劑的制劑可以降低其脫酰胺速率，因為添加有機溶劑會降低溶液的介電常數(shù)。減少溶劑的介電強度-通過加入cosolutes例如甘油，蔗糖和乙醇的蛋白質(zhì)溶液的-導(dǎo)致異構(gòu)化和脫酰胺化的顯著較低速率。將介質(zhì)的介電強度從80（水）降低到35（PVP /甘油/水配方），導(dǎo)致肽脫酰胺速率降低了約六倍。較低的脫酰胺速率歸因于天冬酰胺脫酰胺途徑中環(huán)化過程中形成的穩(wěn)定性較差的離子中間體。在含有苯酚的中性溶液中制備的胰島素顯示出減少的脫酰胺作用，這可能是因為其對脫酰胺殘基周圍的三級結(jié)構(gòu)（α-螺旋形成）具有穩(wěn)定作用，從而降低了形成中間體酰亞胺的可能性。
聚集與沉淀
聚集蛋白是生物制藥產(chǎn)品的重要關(guān)注點，因為它們可能與生物活性降低和免疫原性增加有關(guān)。大分子蛋白質(zhì)復(fù)合物可以觸發(fā)患者的免疫系統(tǒng)將蛋白質(zhì)識別為“非自身”并引發(fā)抗原反應(yīng)。大型高分子聚集體也會影響器官系統(tǒng)（例如眼睛）中的流體動力學(xué)。
聚集是蛋白質(zhì)生產(chǎn)和儲存過程中遇到的常見問題。蛋白質(zhì)暴露于液-氣，液-固乃至液-液界面通常會增強聚集形式的潛力。攪動的機械應(yīng)力（搖動，攪拌，移液或通過試管泵吸）會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。凍結(jié)和解凍也可以促進它。溶液條件（例如溫度，蛋白質(zhì)濃度，pH和離子強度）會影響所觀察到的聚集體的速率和數(shù)量。蔗糖水解時，由于蛋白質(zhì)糖基化，蔗糖中的制劑會隨著時間的推移而增加聚集。某些配體（包括某些配體）的存在可能會增強聚集。與金屬表面的相互作用會導(dǎo)致外延變性，從而觸發(fā)聚集體形成。從環(huán)境中的雜質(zhì)粒子，制造過程中，或容器封閉系統(tǒng)（例如，硅油）也能誘導(dǎo)聚合。甚至在復(fù)合藥房中處理蛋白質(zhì)產(chǎn)品，也可以誘導(dǎo)聚集，其聚集量比最初觀察到的量高10倍。
聚集對產(chǎn)物效力的影響根據(jù)每種蛋白質(zhì)相對于其功能域的生理化學(xué)特性和所測活性的性質(zhì)而變化。搖動后，諸如脲酶和過氧化氫酶之類的酶可能會損失多達50％的效力，剪切應(yīng)力后纖維蛋白原的凝結(jié)活性會降低，并且搖動和剪切產(chǎn)生的聚集會嚴重影響重組IL-2和重組干擾素的活性。聚集也影響蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量平衡，降低了目標蛋白質(zhì)的濃度。在存儲過程中，隨著時間的推移，在制造過程中任何地方產(chǎn)生的微聚集的亞可見顆粒都可能隨著時間的推移而發(fā)展成更大的顆粒。在藥房操作后，貝伐單抗藥物產(chǎn)品損失了50％的活性IgG，從而導(dǎo)致重新包裝的溶液中微米級顆粒的顯著生長。
聚集體可以是可溶或不可溶，可逆或不可逆，共價或非共價?？扇苄跃奂w通常是可逆的：例如，通過改變?nèi)芤簵l件（例如改變溫度或滲透強度）或通過輕微的物理破壞（例如渦旋或過濾）。不溶性聚集體通常是不可逆的。在劇烈的物理干擾（例如，攪動或冷凍和解凍）下或在存儲過程中，隨著時間的流逝，它們可能長成最終可能沉淀的顆粒。當單體蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)交聯(lián)時，例如通過二硫鍵，就會形成共價聚集體。盡管共價鍵對于穩(wěn)定大多數(shù)多肽蛋白的天然三級結(jié)構(gòu)是必需的，但是通過降解形成的那些可以在蛋白部分之間產(chǎn)生不希望的交聯(lián)，從而導(dǎo)致不可逆的聚集。當?shù)鞍踪|(zhì)基于電荷或極性的結(jié)構(gòu)區(qū)域結(jié)合并結(jié)合時，會形成非共價聚集體。由于此類關(guān)聯(lián)較弱（相對于共價鍵），因此它們對溶液條件敏感，通常是可逆的。
涉及的機理和因素：由于在上游生產(chǎn)和下游加工中需要進行許多物理和化學(xué)操作，然后進行配制和填充操作，因此在該過程的幾乎每個步驟（包括固定點，運輸和運輸）中都可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)生物藥物的聚集。長期儲存，攪動（例如，搖動，攪拌和剪切）蛋白質(zhì)溶液可以促進氣液界面處的聚集，在該處，蛋白質(zhì)分子可能會排列并展開，從而使它們的疏水區(qū)域暴露于基于電荷的締合中。在許多蛋白質(zhì)產(chǎn)品中都發(fā)現(xiàn)了激蕩誘導(dǎo)的聚集，包括重組因子XIII，人類生長激素，血紅蛋白和胰島素。在制造過程中（以及在產(chǎn)品使用過程中），由攪動引起的泡沫最小化對于防止蛋白質(zhì)活性顯著損失或可見顆粒物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要。
蛋白質(zhì)濃度還可以促進聚集，無論是否發(fā)生攪動事件。從兩種PEG化蛋白和一種Fc融合蛋白獲得的結(jié)果表明，在非攪動（靜止）條件下蛋白質(zhì)濃度與聚集之間存在直接相關(guān)性，但研究人員發(fā)現(xiàn)在搖動，渦旋和模擬運輸條件下蛋白質(zhì)濃度與聚集之間存在反相關(guān)性。
多劑量制劑中使用的抗菌防腐劑也可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集。例如，苯甲醇會促進rhGCSF的聚集，因為它有利于蛋白質(zhì)的部分未折疊構(gòu)象。抗菌防腐劑含量的增加可能會增加制劑的疏水性，并可能影響蛋白質(zhì)的水溶性。
苯酚和米甲酚可以顯著破壞蛋白質(zhì)：苯酚促進形成可溶性和不溶性聚集體的，而米甲酚可以沉淀蛋白質(zhì)。
冷凍和解凍-在蛋白質(zhì)治療劑的生產(chǎn)和使用過程中可能多次發(fā)生-會極大地影響蛋白質(zhì)的聚集。在容器的外圍（傳熱最大的地方）產(chǎn)生的水冰晶體會產(chǎn)生“鹽析”效應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)和賦形劑越來越集中在容器的較慢冷凍中心。高鹽和/或高蛋白濃度可導(dǎo)致冷凍過程中沉淀和聚集，解凍時不能完全逆轉(zhuǎn)。可以通過刺激甲狀腺的激素看到效果：當在−80°C，4°C或24°C下存儲長達90天時，它保持穩(wěn)定，但是在冷凍至−20°C時它損失> 40％在那個時期的效力，歸因于亞基的解離。多次冷凍和解凍循環(huán)會加劇這種影響，并導(dǎo)致對亞可見顆粒和可見顆粒的產(chǎn)生和生長的累積影響。pH值的變化可能來自冷凍過程中緩沖液成分的結(jié)晶。在一項研究中，磷酸鉀緩沖液在冷凍時的pH變化比磷酸鈉緩沖液小得多。
概略目前限制的顆粒≥10微米的數(shù)量和≥25微米大小可存在于可注射的藥物制劑。但是，什么級別的亞可見粒子。同樣，對于蛋白質(zhì)藥物中的可見顆粒，也沒有標準的法規(guī)。一些生物技術(shù)產(chǎn)品具有藥物溶液的視覺外觀規(guī)格，其中包括諸如“基本上不含可見顆粒”或“可能存在一些半透明顆粒”之類的注釋）。
預(yù)防措施：通過優(yōu)化溶液的pH值和離子強度，通常可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的聚集和沉淀。添加糖，氨基酸和/或多元醇；并使用表面活性劑。最佳pH和滲透條件的綜合評估是防止蛋白質(zhì)聚集或沉淀的制劑開發(fā)的關(guān)鍵要素）。用表面活性劑，多元醇或糖類可以防止由于變性引起的不可逆的聚集。
在許多情況下，添加非離子型去污劑（表面活性劑）可提高穩(wěn)定性并防止聚集。蛋白質(zhì)-表面活性劑之間的相互作用是疏水的，因此這些化合物通過降低溶液的表面張力并結(jié)合其表面上的疏水位點來穩(wěn)定蛋白質(zhì)，從而降低了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能導(dǎo)致聚集體形成的可能性。非離子型洗滌劑Tween 20和Tween 80可以防止表面活性劑濃度低于臨界膠束濃度（CMC）的可溶性蛋白質(zhì)聚集體的形成。添加到IgG溶液中的聚山梨酯（Tween）80可以穩(wěn)定小聚集體，并防止它們長成更大的顆粒。螯合劑也可用于防止金屬誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集。
碎片化
具有兩個或多個亞基的多聚體蛋白可以解離為單體，而單體（或單個肽鏈蛋白）則可以降解為肽片段。非酶片段化通常是通過氨基酸之間的肽鍵水解而進行的，從而釋放出分子量低于完整親本蛋白的多肽。天冬氨酸-甘氨酸的肽鍵和Asp-Pro的是最容易受到水解蛋白切割?？贵w水解通常發(fā)生在鉸鏈區(qū)，這是抗體最靈活的結(jié)構(gòu)域。
但是，將pH從9降低到5可以改變重組單克隆抗體的肽水解位點，顯示該區(qū)域之外的裂解增加。
寡糖的存在和位置也會影響低pH值下肽水解的速率。根據(jù)位置，盡管CH 2結(jié)構(gòu)域中的片段減少，但鉸鏈區(qū)的裂解并未受到影響。酸性和堿性水解作用對肽鍵的水解裂解不一定具有相同的作用。重組人巨噬細胞集落刺激因子在酸性和堿性pH值的溶液中產(chǎn)生不同的肽片段。殘留或污染性蛋白酶的蛋白水解活性可能會導(dǎo)致酶蛋白斷裂，或者在某些情況下會導(dǎo)致酶蛋白的自身蛋白水解。
預(yù)防措施：對于每種蛋白質(zhì)類型，適當緩沖制劑以使其溶液的pH值保持在合適的范圍內(nèi)，是最大限度地減少水解片段化的關(guān)鍵。例如，降鈣素在堿性pH下進行水解，但是即使在室溫下，在pH 7下也未觀察到這種降解。緩沖液的組成也可能影響水解。在相同的pH和離子強度下，在磷酸鹽緩沖液中觀察到重組人巨噬細胞集落刺激因子片段化，而在組氨酸緩沖液中則未觀察到。從生產(chǎn)過程的內(nèi)在來源（例如宿主細胞蛋白）或外源性污染源（例如不定微生物）中最小化蛋白酶在蛋白質(zhì)純化中的潛在存在也很重要。
蛋白質(zhì)分子的天然結(jié)構(gòu)是平衡效應(yīng)的結(jié)果，例如共價鍵，疏水相互作用，靜電相互作用，氫鍵和范德華力。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性受無數(shù)內(nèi)在和外在因素控制，但主要因素是一級序列，3D結(jié)構(gòu)，亞基締合和翻譯后修飾。外在影響因素包括pH，摩爾滲透壓濃度，蛋白質(zhì)濃度，制劑賦形劑，以及產(chǎn)品在溫度，光照和/或攪拌下受到的物理壓力。容器密閉系統(tǒng)中的可浸出物和環(huán)境污染（例如，金屬和蛋白酶）也加劇了產(chǎn)品降解。綜上所述，所有這些特征使蛋白質(zhì)降解成為非常復(fù)雜的物理化學(xué)現(xiàn)象，因此優(yōu)化配方是生物技術(shù)產(chǎn)品開發(fā)的關(guān)鍵方面。
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來源：藥時空
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