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反相鍵合相色譜法（C18，C8固定相）是目前最常用的一種色譜方法，當(dāng)采用它進(jìn)行藥品雜質(zhì)檢查，特別是響應(yīng)因子較低的雜質(zhì)的檢查時(shí)，為了提高方法對(duì)雜質(zhì)的檢測(cè)能力，通常采用較大的進(jìn)樣量，這時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)色譜柱對(duì)主成分的過載。

 

按色譜動(dòng)力學(xué)的解釋，過載是由等溫非線性分配引起。色譜理論認(rèn)為，組分在固定相和流動(dòng)相中按比例分配，當(dāng)固定相和流動(dòng)相一定時(shí)，分配系數(shù)只是溫度的函數(shù)。當(dāng)組分的量在一定范圍內(nèi)時(shí)，分配系數(shù)不變，組分在分配固定相中的量（MS）和流動(dòng)相中的量（Mm）服從線性關(guān)系；當(dāng)組分的量超過該范圍，分配將偏離線性（等溫非線性分配），色譜柱過載。過載有以下兩種情況：

 

 

第一種情況如圖1所示，色譜柱過載后，隨著組分量的增加，k’變小。表現(xiàn)在譜帶上就是濃度越大的區(qū)域遷移越快，表現(xiàn)在色譜圖上就是出現(xiàn)一個(gè)呈近似直角三角形的拖尾的色譜峰（過載拖尾）。

 

第二種情況如圖2所示，色譜柱過載后，隨著組分量的增加，k’變大。表現(xiàn)在譜帶上就是濃度越大的區(qū)域遷移越慢，表現(xiàn)在色譜圖上就是出現(xiàn)一個(gè)呈近似直角三角形的前延的色譜峰。

 

一般在HPLC中第一種情況很常見，以下主要討論過載拖尾的情況。

 

1.過載拖尾峰的峰型特征和危害

一般呈近似直角三角形，進(jìn)樣量越大，拖尾越嚴(yán)重，保留時(shí)間越短。雖然不同進(jìn)樣量下保留不一致，但色譜峰卻都在同一時(shí)間結(jié)束。

 

由于峰結(jié)束的位置不變，所以這種拖尾峰對(duì)其后面的雜質(zhì)分離不會(huì)有影響，但卻容易覆蓋前面的雜質(zhì)峰，對(duì)它們的分離不利。

 

2.影響過載的因素及解決辦法

（1）柱容量

柱容量越大越不容易過載。決定柱容量的指標(biāo)是柱截面上固定相的面積占比，它與空容、填料的比表面積、表面健合率等色譜參數(shù)有關(guān)。

 

需要注意的是，增加柱長(zhǎng)并不能增加柱容量，因?yàn)闃悠愤M(jìn)樣后不可能立即分布于整個(gè)色譜柱，同樣因?yàn)闊o限直徑效應(yīng)的緣故，增大柱內(nèi)徑也不能增大柱容量。

 

（2）進(jìn)樣量

顯然，減小進(jìn)樣量可以緩解過載，有時(shí)還能夠達(dá)到分離雜質(zhì)的效果。

 

如圖4所示，進(jìn)樣量減小一半，主成分前相鄰雜質(zhì)峰從主成分峰中分離出來，但方法對(duì)雜質(zhì)的檢出能力也隨著降低。

 

（3）組分分配到固定相中的量

柱容量一定時(shí)，分配到固定相中的量越少，保留越小，柱越不容易過載。理論上，在固定相中不分配時(shí)，組分不保留，再大的進(jìn)樣量也不會(huì)出現(xiàn)過載。對(duì)于C18/C8健合固定相，可以通過增加有機(jī)相比例減小組分在固定相中的分配來緩解過載，當(dāng)然，隨著有機(jī)相的改變，方法選擇性也會(huì)發(fā)生變化。

 

圖5中，有機(jī)相比例增加，保留減小，過載緩解，拖尾因子減小。

 

（4）組分的存在方式

對(duì)于易解離組分如酸堿性物質(zhì)，在流動(dòng)相緩沖容量足夠的情況下，譜帶上任一點(diǎn)解離型（離子）和非解離型（分子）的比例始終一致，離子型和分子型相伴以恒定的比例流出色譜柱，出現(xiàn)的色譜峰是離子型和分子型的疊加。

 

 

如果其中一個(gè)組分過載，表現(xiàn)出一個(gè)拖尾的色譜峰，另一組分雖未過載，但由于上述原因，也會(huì)表現(xiàn)為和過載組分形狀一致大小不同的過載峰。因此易解離組分的峰型由過載的那一種存在方式?jīng)Q定。

 

一般離子型比分子型組分更容易過載，故易解離組分的過載由離子型的過載決定，過載程度與其占比有關(guān)。一般通過調(diào)整流動(dòng)相pH抑制組分解離可大大減小離子型比例，緩解甚至消除過載。

 

對(duì)于強(qiáng)酸/堿性物質(zhì)，難以通過調(diào)節(jié)pH抑制解組分的解離，這個(gè)時(shí)候可以通過形成離子對(duì)復(fù)合物來減小離子型占比以緩解過載。同樣地，過載由離子型決定，形成的離子對(duì)復(fù)合物越多，離子型就越少，過載就越能得到緩解。

 

更復(fù)雜的情況是既抑制解離又存在離子對(duì)試劑的時(shí)候，這個(gè)時(shí)候可以通過上述兩方面來改變離子型的占比，既可以緩解過載拖尾，又可以調(diào)整保留。情況雖然復(fù)雜，但手段卻更加靈活多樣。

 

（5）鹽的濃度

對(duì)于離子型組分在C18/C8固定相上易于過載的原因，主要是因?yàn)殡x子型組分一旦進(jìn)入固定相以后，離子間的排斥作用會(huì)阻止組分的進(jìn)一步進(jìn)入。

 

我們通常使用緩沖鹽主要是為了維持流動(dòng)相有足夠的緩沖容量，但另一方面緩沖鹽甚至是中性鹽的加入還可以增加流動(dòng)相離子強(qiáng)度，部分屏蔽組分離子間的相互排斥作用，減輕過載。同時(shí)鹽還可以與離子組分形成離子對(duì)復(fù)合物，降低組分離子型比例來緩解過載。鹽濃度越大，效果越明顯。

 

以下以某一堿性化合物為例，通過實(shí)驗(yàn)探討鹽對(duì)過載行為的影響。該化合物含一個(gè)疏水性較強(qiáng)的芳香基團(tuán)和一個(gè)伯氨基，堿性較強(qiáng)，pKa為9.9，在試驗(yàn)所用流動(dòng)相pH下幾乎全部以解離型存在。以下所有試驗(yàn)流動(dòng)相緩沖液pH均用磷酸調(diào)節(jié)到2.5；流動(dòng)相中有機(jī)相均為乙腈，除圖中標(biāo)出乙腈比例外，均為緩沖鹽：乙腈=80：20；柱溫30℃；測(cè)試波長(zhǎng)210nm；色譜柱為AgilentSB-C18（4.6*150mm，5um）；供試品濃度為1mg/ml；進(jìn)樣體積為10uL。

 

 

圖7表明，隨著緩沖鹽濃度的增加，過載得以緩解，峰拖尾因子逐漸減小。即使加入中性鹽硫酸鈉，也能起到相似作用。

 

 

圖8中50mmol/L的硫酸鈉起到比100mmol/L磷酸二氫鉀更好的緩解過載拖尾的效果，因此50mmol/L的硫酸鈉離子強(qiáng)度更大的緣故。

 

圖7中三個(gè)色譜峰沒有在同一時(shí)間結(jié)束，說明隨著緩沖鹽濃度的增加，容量因子發(fā)生變化。圖中可以看出，鹽濃度越大，容量因子越大，說明組分與緩沖鹽中磷酸二氫根陰離子形成了保留更強(qiáng)的離子對(duì)復(fù)合物。唯一令人費(fèi)解的是，圖7中使用50mmol/L的硫酸鈉時(shí)容量因子沒有如愿增加。

 

緩沖鹽與離子型組分形成離子對(duì)復(fù)合物所占比例到底有多少一直是筆者想知道的一個(gè)問題。其比例可以通過下式進(jìn)行計(jì)算：

 

k’=x離子型﹒k’離子型+x離子對(duì)型﹒k’離子對(duì)型

x為各存在方式的占比，k’為相應(yīng)的容量因子。

 

離子對(duì)復(fù)合物的保留應(yīng)與分子型的保留相當(dāng)，考慮到組分堿性較強(qiáng)，要測(cè)定組分分子型的保留值，需要完全抑制組分解離，流動(dòng)相pH需要高達(dá)12以上，這在普通的C18柱上難以實(shí)現(xiàn)，故以伯氨基被酰胺取代的化合物代替該物質(zhì)的分子型，并以此測(cè)得的保留值作為離子對(duì)復(fù)合物的保留值來及計(jì)算k’離子對(duì)型。

 

k’離子型用緩沖液鹽濃度最低時(shí)（5mmol/L）的k’代替。

 

各緩沖液濃度下組分色譜峰均存在不同程度過載拖尾，故保留時(shí)間以色譜峰結(jié)束時(shí)的時(shí)間估算，應(yīng)不至于產(chǎn)生太大誤差（其實(shí)應(yīng)于各條件下取低濃度組分進(jìn)樣，色譜峰不至于過載，能獲得組分的準(zhǔn)確保留值）。

 

 

由此可見，即使緩沖鹽濃度高達(dá)100mmol/L，緩沖鹽中磷酸二氫根陰離子與組分陽(yáng)離子形成離子對(duì)復(fù)合物的比例仍不及1%。

 

一般離子極化能力越強(qiáng)，水合離子半徑越大，形成離子對(duì)復(fù)合物能力也越強(qiáng)。PF6—與

ClO4—以其強(qiáng)大的極化能力和較大的水合離子半徑使其在所有陰離子對(duì)試劑中在形成離子對(duì)能力方面名列前茅。一般PF6—＞ClO4—＞＞其他陰離子。

 

圖9中采用六氟磷酸鉀比采用相同濃度的高氯酸鈉有更強(qiáng)的保留，顯示PF6—比ClO4—更強(qiáng)的形成離子對(duì)復(fù)合物的能力,相應(yīng)地前者比后者更大程度的緩解了過載，拖尾因子也較低。

 

 

圖10中55.8min的為酰胺取代物的保留值，用它代替離子對(duì)復(fù)合物的保留值，計(jì)算出50mmol/L高氯酸鈉和50mmol/L六氟磷酸鉀與組分形成離子對(duì)復(fù)合物的比例分別為9.2%和22.7%。

 

既然過載由離子型引起，那就可以增加流動(dòng)相中乙腈比例，減小離子型在固定相中的分配來減輕甚至消除過載。圖11是將流動(dòng)相中乙腈比例增加到40%，此時(shí)幾乎全部以離子型存在的組分在固定相中幾乎不分配，色譜圖也沒有顯示出過載特征（T=1.11）。

 

然而不（低）分配也意味著不（低）保留，為了使主份有一定保留，可通過添加離子對(duì)試劑實(shí)現(xiàn)。圖11添加50mmol/L高氯酸鈉即使組分實(shí)現(xiàn)保留，同時(shí)色譜峰拖尾因子仍與幾乎不保留時(shí)一致，進(jìn)一步證明過載由離子型引起，緩解了離子型的過載就緩解了整個(gè)色譜峰的過載。

 

高乙腈比例使離子型組分在固定相中不分配以消除過載拖尾，添加離子對(duì)高氯酸鈉來實(shí)現(xiàn)組分的合適保留是以上我們用到的方法。為了到達(dá)更強(qiáng)的保留，我們還可以使用帶有不同碳鏈的烷基磺酸鹽/硫酸鹽類疏水性離子對(duì)試劑。如使用庚烷磺酸鈉等。這類離子對(duì)試劑由于其形成離子對(duì)復(fù)合物能力很弱，加之使用濃度一般都很低（零點(diǎn)幾到數(shù)個(gè)mmol/L），故形成的離子對(duì)復(fù)合物濃度很低，難以有效降低離子型組份的占比，對(duì)緩解過載幾無貢獻(xiàn)。但因?yàn)殚L(zhǎng)的碳鏈的緣故，其形成的為數(shù)不多的離子對(duì)復(fù)合物的k’甚至遠(yuǎn)大于分子型組分的k’，故可以很好的延長(zhǎng)組分的保留。

 

對(duì)于這類離子對(duì)試劑的保留機(jī)理，相比于高氯酸鈉和六氟磷酸鉀，由于其強(qiáng)的疏水性，除了上述形成離子對(duì)復(fù)合物的外，還存在一種所謂“動(dòng)態(tài)離子交換”保留模式，即離子對(duì)試劑分布在C18上形成帶有陽(yáng)離子交換功能基的另一種動(dòng)態(tài)的固定相，對(duì)陽(yáng)離子組分有類似離子交換的保留作用。該離子交換的有效柱容量與流動(dòng)相中有機(jī)相比例有關(guān)，因流動(dòng)相中有機(jī)相與離子對(duì)在固定相上的分布存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，流動(dòng)相中有機(jī)相中有機(jī)相比例越大，分布在C18上的離子對(duì)越少，離子交換的有效柱容量越低。

 

組分在這種離子對(duì)試劑模式下的過載除了離子型在C18過載外，還包括離子型在所謂“離子交換固定相”上的過載。緩解或消除這兩種過載的簡(jiǎn)單有效的方式是流動(dòng)相中采用高有機(jī)相比例減少離子型組分在C18固定相上的分配，同時(shí)流動(dòng)相中采用高鹽濃度減少離子型組分在“離子交換固定相”上的分配。

 

 

圖12兩個(gè)色譜峰流動(dòng)相均采用 40%乙腈，此時(shí)離子型組分在C18固定相上的過載基本被消除，流動(dòng)相鹽的濃度為5mmol/L時(shí)過載拖尾明顯，蓋因離子型在“離子交換固定相”上的過載所致，流動(dòng)相鹽濃度增加至50mmol/L時(shí)拖尾明顯緩解。

 

更長(zhǎng)碳鏈的離子對(duì)試劑的使用一直是個(gè)麻煩！如十二烷基硫酸鈉，因?yàn)楹苋菀讓?dǎo)致峰型畸形。

 

 

圖13水相中均還含有5mmo/L十二烷基硫酸鈉，緩沖鹽濃度高達(dá)100mmol/L峰型才達(dá)到正常，分析原因，可能是長(zhǎng)碳鏈的離子對(duì)在C18上分布時(shí)容易引起取向混亂，導(dǎo)致形成“離子交換固定相”的硫酸鈉基團(tuán)在C18上分布不均引起。增加流動(dòng)相中鹽濃度能減弱甚至消除離子交換作用，使這種不均一的“離子交換固定相”的保留作用減小直至消除。

 

（6）梯度洗脫

在梯度洗脫過程中，一方面隨著流動(dòng)相有機(jī)相比例逐漸增加，組分在固定相中的分配也逐漸降低，過載的累積也就逐漸減輕。另一方面，對(duì)于低有機(jī)相比例洗脫時(shí)組分已經(jīng)形成過載峰這一既定事實(shí)，梯度洗脫特有的所謂“譜帶壓縮機(jī)制”也可以進(jìn)行部分“逆轉(zhuǎn)”。我們知道，對(duì)于過載的譜帶，組分濃度沿著柱入口到柱出口方向逐漸增加，而高有機(jī)相比例的流動(dòng)相總是首先到達(dá)靠近柱入口的低濃度組分譜帶區(qū)域，使它們不停追趕靠近柱出口的高濃度組分，最終使譜帶壓縮，以前過載拖尾的峰型得到緩解。