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藥物質(zhì)量研究中，含量雜質(zhì)分析方法驗(yàn)證得到了廣泛的關(guān)注與應(yīng)用，包括線性、精密度、準(zhǔn)確度、專屬性、范圍、檢測(cè)限與定量限等。分析方法耐用性也逐漸受到行業(yè)的重視。近年來(lái)新藥發(fā)展迅速，醫(yī)藥外包服務(wù)行業(yè)風(fēng)起云涌，技術(shù)的不同場(chǎng)地轉(zhuǎn)移非常普遍，不同場(chǎng)地研發(fā)分析與質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室間的分析方法轉(zhuǎn)移也經(jīng)常發(fā)生。因此方法轉(zhuǎn)移時(shí)，不僅要符合法規(guī)的要求，還要求實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，這些都對(duì)分析方法的耐用性提出了新的要求與挑戰(zhàn)。

在ICH Q2A指南中，方法耐用性的英文名稱為“robustness”，它與USP的解釋是一致的，定義為“是衡量其不受方法參數(shù)的微小故意變化影響的能力，并在正常使用期間提供可靠性的指標(biāo)”。筆者在一些文獻(xiàn)或書籍中有時(shí)會(huì)見到“ruggedness”一詞來(lái)表示耐用性。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，它表示方法的粗放性。USP對(duì)“ruggedness”解釋為分析方法在各種正常試驗(yàn)條件下，如不同的實(shí)驗(yàn)室、不同的分析員、不同的儀器、不同的試劑批次、不同的分析時(shí)間、不同的分析溫度下，對(duì)同一樣品進(jìn)行分析所獲得試驗(yàn)結(jié)果的可重現(xiàn)性程度。這個(gè)敘述的含義基本等同于中間精密度，因此“robustness”與“ruggedness”兩者的含義是有區(qū)別的，在使用時(shí)需要注意。

ICH Q2A指南中對(duì)方法耐用性的評(píng)估明確指出：耐用性評(píng)估的結(jié)果應(yīng)是建立一系列系統(tǒng)適用性參數(shù)（例如測(cè)試分離度）評(píng)估，以確保在使用時(shí)保持分析方法的有效性。本文試著從耐用性的評(píng)估方式、程序、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與案例分析等方面展開探討液相色譜方法耐用性的研究。

 

1. 方法耐用性的評(píng)估方式

據(jù)ICH/USP對(duì)方法耐用性定義，方法參數(shù)故意的微小變化，選擇合適的響應(yīng)值或者系統(tǒng)適用性結(jié)果來(lái)進(jìn)行評(píng)估。分析方法的影響因素有多種，包括樣品提取方式、流動(dòng)相組成、pH值、流速、柱溫和梯度等。

第一種評(píng)估方式是一次實(shí)驗(yàn)只測(cè)試一個(gè)方法因素的一個(gè)水平變化，比如一次只改變流動(dòng)相pH值，其它方法參數(shù)保持不變，后得到一個(gè)因素變化后的測(cè)試結(jié)果，這種方式稱為單變量一次實(shí)驗(yàn)（one-variable-at-a-time procedure(OVAT)）。可以看出這種方式簡(jiǎn)單易操作，一次只變化一個(gè)因素和一個(gè)水平，因素間不同時(shí)考察。如果因素較大，則實(shí)驗(yàn)次數(shù)也會(huì)較多，方法因素間的交互沒(méi)法評(píng)估，實(shí)驗(yàn)得到的是單變量結(jié)果，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)。

第二種方式是同時(shí)評(píng)估多個(gè)參數(shù)的變化，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。根據(jù)參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察的是多因素多水平對(duì)方法的影響，得到的結(jié)果對(duì)于方法耐用性的判斷更具有意義。

方法耐性的評(píng)估流程大致如下，參考圖1：

選擇方法的考察因素與變化水平

選擇一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

選擇需要測(cè)試的結(jié)果（如分離度，含量回收率）

計(jì)劃與執(zhí)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，收集測(cè)試結(jié)果

量化計(jì)算因素對(duì)結(jié)果的影響

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行圖表或統(tǒng)計(jì)學(xué)分析影

根據(jù)上面的評(píng)估，總結(jié)考察因素與水平對(duì)于方法耐用性的影響

 

圖1:分析方法耐用性測(cè)試的流程步驟

 

2.方法耐用性因素與水平的選擇

不同實(shí)驗(yàn)間方法轉(zhuǎn)移常會(huì)受到環(huán)境因素與操作因素的影響。方法耐用性考察主要研究那些操作因素對(duì)方法的影響，比如流動(dòng)相pH值、緩沖鹽濃度、柱溫、色譜柱廠家與柱批次等。這些因素中有的是可定量因素，如濃度、pH值；有的是可定性因素，如色譜柱廠家與批次。高效液相色譜法可操作因素如表1.

表1:HPLC方法的耐用性因素

因素水平的選擇一般基于方法正常水平選擇大小兩個(gè)水平。水平的大小要考慮該因素的不確定度。比如柱溫，不同色譜儀的柱溫不確定度可以做到±2ºC或者更低，在考察柱溫的水平時(shí)，基于這個(gè)不確定度來(lái)考察柱溫的2-5倍因子。方法正常柱溫是30ºC時(shí)，則考察25ºC和35ºC兩個(gè)水平。這種選擇常依賴于分析操作人員的判斷與經(jīng)驗(yàn)，對(duì)方法熟悉的操作人員，在方法開發(fā)時(shí)會(huì)考察一些關(guān)鍵影響因素，因此對(duì)方法的知識(shí)了解會(huì)比較多，耐用性考察選擇水平能做到適度調(diào)整。水平考察過(guò)寬得到的結(jié)果可能會(huì)測(cè)試結(jié)果影響較大，分離度小于1.5或者含量回收率低于90%；水平考察過(guò)窄，可能會(huì)沒(méi)有找到因素影響的最大可能耐用性區(qū)間，耐用性評(píng)估意義會(huì)打折扣。

因素與水平變化后的檢測(cè)結(jié)果可有多種，比如檢測(cè)分離度、含量回收率等。這些響應(yīng)結(jié)果用來(lái)評(píng)估因素與水平的變化對(duì)方法的影響。表2列出了高效液相色譜法耐用性可選擇的檢測(cè)結(jié)果種類。

表2:HPLC方法耐用性的檢測(cè)評(píng)估結(jié)果

3.方法耐用性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

方法耐用性的實(shí)驗(yàn)通常是考察兩個(gè)水平的結(jié)果變化，基于考察因子的多少，選擇部分因子（fractional factorial, FF）或者篩選因子（Plackett-Burman,PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。假設(shè)有f個(gè)因子，對(duì)于部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)則需要進(jìn)行2f-k（f:因子數(shù)，k：新安排的因子數(shù)）次數(shù)的實(shí)驗(yàn)；當(dāng)考察因子超過(guò)4個(gè)，部分因子實(shí)驗(yàn)的次數(shù)也會(huì)增加較多，實(shí)驗(yàn)室分析工作量會(huì)陡增。另一種可以選擇篩選因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)是12,20,24等，是實(shí)驗(yàn)最少的一種設(shè)計(jì)。它的缺點(diǎn)是當(dāng)因子之間存在顯著的交互作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到。

方法耐用性考察時(shí)，色譜方法影響因子常大于4，因此選擇篩選因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能節(jié)省次數(shù)。表3是篩選因子設(shè)計(jì)表，包含了11個(gè)因子，每個(gè)因子兩水平，基本可以滿足耐用性的考察。

表3:篩選因子設(shè)計(jì)表，“+”代表因子的高水平，“-”代表因子的低水平

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完成后，執(zhí)行實(shí)驗(yàn)操作，得到各因子高水平與低水平的結(jié)果，進(jìn)行處理。不同水平的因子對(duì)方法的影響效應(yīng)（EX）計(jì)算可以通過(guò)下面公式得到：

計(jì)算得到因子影響效應(yīng)的結(jié)果，然后可通過(guò)人工或者軟件計(jì)算得到圖表化的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步識(shí)別某些影響因子效應(yīng)是否顯著，從而判斷因子對(duì)方法耐用性是否產(chǎn)生了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的影響。

圖2是根據(jù)EX結(jié)果得到的正態(tài)或半正態(tài)分布概率圖，顯著影響因子效應(yīng)通常是偏離直線，如圖圈出的點(diǎn)。此外，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以結(jié)合通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，一起評(píng)估因子的影響效應(yīng)。

 

 

圖2, a: 因素影響效應(yīng)的正態(tài)分布概率圖，b: 因素影響效應(yīng)的半正態(tài)分布概率圖

 

4. 案例：MC片劑的含量雜質(zhì)HPLC方法的耐用性考察

該片劑API成分為MC，同時(shí)含有兩個(gè)主要雜質(zhì)成分RC1和RC2。樣品測(cè)試溶液有兩份：一份含有0.25mg/ml MC和0.0125mg/mL RC1與RC2標(biāo)準(zhǔn)品溶液；另一份含有0.25mg/ml MC的片劑樣品溶液。

色譜柱：10cm × 4.6 mm I.D. column, packed with Hypersil BDS-C18, 3 mm，柱溫：室溫，流速1.5mL/min，波長(zhǎng)265nm，水相pH6.8,進(jìn)樣量10uL，流動(dòng)相組成與梯度條件如下表：

 

 

根據(jù)前文敘述的方法影響因素分析，該方法耐用性考察因素選擇流速、水相pH值、柱溫、色譜廠家、梯度起始與終點(diǎn)的變化、緩沖鹽濃度和檢則器波長(zhǎng)。具體的因素與水平選擇如表4。

表4: 方法耐用性的因素與水平

上表選擇了8個(gè)因素考察，利用篩選因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型，選擇11個(gè)因子12次實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)表格，如表5, 由于方法考察8個(gè)因子，故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中有三列是虛擬的因子，我們可以隨機(jī)選擇三列作為虛擬考察因子（如C、G、K列）。

表5: 篩選因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)上表的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，開展12次實(shí)驗(yàn)，每一列代表一個(gè)方法條件，分析分析三針樣品（空白、標(biāo)準(zhǔn)品樣品和樣品溶液）。實(shí)驗(yàn)完成后，收集檢測(cè)的結(jié)果包括MC、RC1和RC2的回收率，MC與RC1的分離度，主峰MC的容量因子，主峰的拖尾因子，最后出峰RC2的保留時(shí)間，具體見如表6。從結(jié)果來(lái)看，主要成分MC與兩個(gè)雜質(zhì)RC1和RC2的含量回收率都在95%-105%的范圍內(nèi)，精密RSD值在2%的范圍內(nèi)，化合物分離度也都大于1.5, 說(shuō)明方法在考察因素發(fā)生微小變化時(shí)，耐用性良好。

由表6的結(jié)果，參考公式1, 可計(jì)算因子隨水平變化時(shí)對(duì)方法的影響效應(yīng)，正態(tài)分布概率圖顯示所有點(diǎn)幾乎在一條直線上，沒(méi)有明顯偏離直線的異常值，具體圖表結(jié)果可見文獻(xiàn)1。對(duì)表6結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)分析，結(jié)論也是沒(méi)有因子對(duì)方法產(chǎn)生的顯著影響，如表7。表7中前三列的回收率結(jié)果顯示在α=0.05水平時(shí)，沒(méi)有觀察到顯著性影響，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度沒(méi)有受到因子水平變化的影響。后面4列有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，說(shuō)明方法因子水平的變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果（分離度、容量因子，拖尾因子和保留時(shí)間）產(chǎn)生了顯著性影響，但這并不意味著方法耐用性不好，也不說(shuō)明方法沒(méi)有在最好狀態(tài)。因?yàn)榉椒ǖ哪陀眯院门c不好，最后反應(yīng)在它的定量準(zhǔn)確性上。

表6: 12次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果匯總

表7:不同因素考察結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

我們可以利用這些受影響的因素找到那些最差的檢測(cè)結(jié)果。比如，pH值、色譜柱、柱溫、B相終比例、緩沖鹽濃度等5個(gè)因子會(huì)顯著影響分離度、MC容量因子和拖尾因子，而B相起始比例、流速和波長(zhǎng)等3個(gè)因子對(duì)方法不產(chǎn)生影響。根據(jù)前面5個(gè)因子的影響效應(yīng)量化結(jié)果，選擇產(chǎn)生負(fù)面影響的5個(gè)因子的水平（+或-），不產(chǎn)生影響的3個(gè)因子選擇方法的正常水平（0），進(jìn)行最差情形實(shí)驗(yàn)，從而得到分離度、MC容量因子和拖尾因子大方法波動(dòng)時(shí)的可能區(qū)間，這些值可作為方法狀態(tài)最差時(shí)的參考值。在設(shè)計(jì)方法系統(tǒng)適用性的限度時(shí)，依據(jù)這些最差值來(lái)進(jìn)行設(shè)定，如表8。

表8(a)計(jì)算結(jié)果預(yù)測(cè)的最差情況的因素水平；(b) 上述不同水平條件測(cè)試后的SST結(jié)果

 

本文對(duì)方法耐用性的評(píng)價(jià)進(jìn)行了探討，包括耐用性評(píng)估方法與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)因子影響效應(yīng)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估，幫助判斷方法耐用性的影響情況。在進(jìn)行方法技術(shù)轉(zhuǎn)移時(shí)，方法參數(shù)變化是經(jīng)常發(fā)生的情況，因此一個(gè)好的QC方法應(yīng)具有一定的耐用性，才能確保檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠性與準(zhǔn)確性。

 

參考文獻(xiàn)：

1. Guidancefor robustness/ruggednesstests in method validation, J. Pharm. Biomed. Anal. 24(2001)723-753.

2. Ruggedness and robustness testing, Journal ofChromatography A, 1158(2007) 138-157