中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

羥基磷灰石（HA）是誘導骨再生的代表物質，本文用聚乙烯亞胺（PEI）包覆從馬骨中提取的羥基磷灰石（EH）制成一種比25kD PEI性能更好、毒性更低的新型非病毒基因載體（pEH），將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2)基因導入pEH，并將其導入細胞。結果表明，BMP-2/pEH組骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)和矮小相關轉錄因子2(RUNX2)的表達顯著增加，從而促進了成骨細胞的分化。

 

01研究內容簡介

 

羥基磷灰石(HA)是一種由磷酸鈣組成的礦物質，是骨的主要成分。該材料已在組織工程學中用于骨再生。HA可以人工合成，也可以從天然來源獲得。我們研究小組發(fā)現(xiàn)，從豬或馬骨中提取的合成HA和天然HA之間沒有顯著差異（表1）。表1顯示了馬骨合成羥基磷灰石和天然羥基磷灰石的元素組成。一般說來，HA被用作骨再生的材料，但我們試圖將天然HA修飾成一種基因載體，一種分子生物學工具，同時試圖利用這種帶有成骨分化特異性基因的新型載體來促進骨分化。

 

表1馬骨合成羥基磷灰石和天然羥基磷灰石的元素組成。

 

基因轉染的方法通常分為使用病毒載體和使用非病毒載體。病毒載體在導入基因方面比其他方法更有效。然而，使用該病毒存在潛在的危險，可能會導致意外的免疫反應或不想要的基因表達。使用非病毒方法主要有兩種方式。一種是物理方法，對細胞外部施加物理沖擊，從而導入基因。另一種方法是化學方法。磷酸鈣、陽離子脂質和陽離子聚合物可以與靶DNA結合或含有目的DNA并穿過細胞膜。這些方法的優(yōu)點是潛在風險低，但缺點是基因轉移效率低。

 

BMP-2具有良好的骨再生效果。因此，使用BMP-2蛋白治療骨缺損已經(jīng)進行了很多研究。此外，通過將BMP-2基因轉移到骨缺損部位來進行骨再生的基因治療也進行了研究。結果觀察到骨缺損的恢復。研究人員已經(jīng)使用陽離子聚合物、腺病毒和質粒來傳遞BMP-2基因。

 

在這項研究中，我們不僅嘗試使用最具代表性的聚合物25kD PEI和EH的復合物來開發(fā)一種新型的基因載體，而且使用BMP-2質粒和我們的基因載體誘導成骨分化。圖1顯示了這項研究的策略。

 

 

圖1.本研究的策略。(A)從馬骨中提取的羥基磷灰石在水中往往會聚集在一起。(B)通過在馬骨上涂覆 PEI，每個顆粒分布均勻。(C)PEI包覆的馬羥基磷灰石(pEH)含有基因，使其更容易進入細胞。

 

我們用電子顯微鏡(SEM和TEM)觀察了pEH(圖3)。結果表明，超聲處理的納米級EH完全沒有分散，而是聚集在一起。然而，pEH不僅分布均勻，而且大部分粒徑小于500 nm。(圖3B)。

 

圖3電子顯微鏡的圖像分析。(A)EH和pEH的掃描電子顯微鏡圖像((比例尺=2μm和200 nm)。(B)EH和pEH的透射電子顯微鏡圖像(比例尺=0.5μm和2 0 0 nm)。

 

因此，我們試圖確保25kD的PEI正確包裹EH粒子并幫助它們分散。我們使用了三種方法來確認這一過程。第一種方法是EDS。假設在EH表面涂覆含有多個胺基的25kD PEI，表面會有氮存在。EDS結果表明，EH表面未發(fā)現(xiàn)氮元素。然而，在pEH的表面發(fā)現(xiàn)了氮元素(5.32%)(圖4A和B)。第二種方法是測量每個樣品超聲處理后鈣離子濃度的變化。一般來說，羥基磷灰石晶體結構內部有鈣離子，外部有磷酸基團。因此，如果EH的磷酸基與PEI的胺基結合在一起，不僅可以覆蓋整個EH顆粒，而且超聲作用后鈣離子也不會釋放出來。圖4C顯示了EH和pEH釋放的鈣離子濃度的測量結果。兩組鈣離子釋放結果有顯著性差異。正如預期的那樣，pEH組鈣離子釋放較少。第三種方法采用傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)，以確認樣品的組成(圖4D)。與所有樣品相比，只有pEH同時具有PO43-−官能團和胺官能團。通過這些實驗，我們證實EH被25kD的PEI包覆得很好。

 

 

圖4 EH和pEH的化學成分分析。(A)EH和pEH的能量色散光譜分析(EDS)結果。(B)EH和pEH中元素含量的分布圖。(C)EH和pEH的鈣濃度比較。(D)EH、25kD PEI和pEH的FT-IR分析。

 

當使用陽離子聚合物將基因導入細胞時，適當?shù)妮d體正電荷對于抓住帶負電荷的DNA并穿過帶負電荷的細胞壁是很重要的。然后，我們測量了EH和pEH在不同濃度組合下的Zeta電位(圖5)。結果正如預期的那樣，只有基因和EH帶負電荷，而25kD的PEI帶正電荷。用25 kD PEI包覆的EH顯示出比單獨用25 kD PEI更強的正電荷。前者的Zeta電位約為后者的兩倍。與基因結合后，pEH的Zeta電位略低，但仍然比25kD的PEI有更高的電位。根據(jù)這些結果，我們假設pEH比25kD的PEI具有更多的陽離子支鏈，這是因為pEH是EH和幾種PEI聚合物的復合物，因此可以給它帶來更大的電場。我們還想知道，具有比25kD PEI更強的正電荷的pEH是否能夠傳遞基因，或者表現(xiàn)出比25kD PEI更好的性能。

 

 

圖5 pEH/DNA復合物的物理化學特征。(A)-(E)幾種材料的Zeta電位。(A)DNA(2 4.6±8.3 mV)；(B)EH(−38.7±3.1 mV)；(C)25kD PEI(28.4±0.9 mV)；(D)pEH(64.7±1.2 mV)；(E)pEH與DNA(49.7±2.5 mV)。(F)Zeta電位的定量分析。

 

首先，在不同N/P比的瓊脂糖凝膠上進行DNA滯留分析，證明pEH能很好地凝聚DNA形成復合物。結果表明，在0.5N/P比下，pEH與DNA形成了很好的復合物，并表明它可以形成比25kD PEI更好的復合物(圖6A)。說明pEH的基因載藥率高于PEI。

 

接下來，為了證實pEH的基因轉移能力，用熒光素酶分析方法對NIH3t3細胞進行了分析，NIH3t3細胞是一種合適的轉染細胞系。令人驚訝的是，與25kD的PEI相比，pEH顯示出優(yōu)異的基因轉移能力。在建立了用pEH進行基因傳遞的條件后，再次在牙髓干細胞(DPSCs）中進行熒光素酶活性測定。結果，在pEH/pGL3處理組中，熒光素酶的表達效率幾乎是25kD PEI的兩倍(圖6B)。

 

一般來說，根據(jù)陽離子聚合物和基因復合物的大小，內吞作用有四種方式(微胞飲作用：≥1μm，依賴于網(wǎng)格蛋白的內吞作用：~200 nm，不依賴于網(wǎng)格蛋白的內吞作用：~90 nm，依賴胞膜窖的內吞作用：~60 nm)。在pEH的情況下，由于其平均大小小于500 nm，預計它將發(fā)生在除胞膜窖依賴的內吞作用之外的三種內吞作用途徑中。接下來，我們比較了pEH和25kD PEI的細胞毒性(圖6C)。轉染后25kD PEI處理組比pEH處理組有更強的細胞毒性。這些實驗得出了一個有趣的結論。也就是說，與25kD的PEI相比，pEH具有更低的細胞毒性和更好的基因轉染能力。

 

 

圖6 pEH和細胞毒性試驗轉染結果。(A)凝膠滯留試驗。(B)用pEH轉染后的熒光素酶檢測結果。(C)25kD PEI和pEH處理后的細胞存活率分析。

 

在驗證了pEH作為基因載體后，我們分析了BMP-2基因轉染 DPSCs后是否誘導成骨分化。圖7A顯示了綠色熒光蛋白(GFP)標記的BMP-2質粒/pEH傳遞后的結果。結果表明，pEH比25kD PEI能更好地將BMP-2基因導入細胞。轉染2周后進行茜素紅染色分析。BMP-2/pEH處理組的細胞染成最清晰的紅色(圖7B)。為更準確地確定成骨分化標志物的表達，采用蛋白質印跡法證（Western blot）分析成骨分化標志物的表達。骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)是干細胞分化為骨細胞時表達的主要標志物。矮小相關轉錄因子2(RUNX2)是一種與成骨細胞分化相關的重要轉錄因子，其表達受BMP-2調控。令人驚訝的是，在BMP-2/pEH治療組中，與EH治療組相比，RUNX2增加了170%以上，OCN增加了160%以上，OPN增加了70%以上。此外，BMP-2/pEH處理組的各表達標記物均顯著高于BMP-2/25kD PEI處理組(圖7C)。特別是，使用pEH輸送BMP-2質粒時，RUNX2的表達量與使用25kD PEI時大約相差4倍。這意味著BMP-2/pEH促進了BMP-2蛋白的表達，從而誘導了RUNX2的表達，并誘導了RUNX2誘導的其他標志物的表達。通過這些結果證實，用pEH將BMP-2基因導入干細胞，可以很好地誘導成骨分化。

 

圖7使用攜帶pEH的BMP-2質粒進行成骨分化。(A)用pEH(比例尺=100μm)轉染后，綠色熒光蛋白標記的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達結果。(B)BMP-2/pEH處理2周后茜素紅染色結果。(比例尺=100μm)。(C)BMP-2/pEH處理2周后的Western blot結果。

 

綜上所述，我們研制的載體具有回收廢棄農副產(chǎn)品的優(yōu)勢。此外，我們希望在利用棄置禽畜廢物的新領域進行更積極的應用研究。我們的工作是首次利用馬骨來源的改性羥基磷灰石構建基因傳遞系統(tǒng)，并利用該方法誘導骨分化，這是一項非常創(chuàng)新的研究。我們的團隊將嘗試使用這種通過DPSCs成功誘導骨分化的系統(tǒng)進行牙齒再生，并計劃深入研究新的可再生生物材料的使用。

 

02論文第一/通訊作者簡介

 

第一作者：Myung Chul Lee

 

Department of Biosystems & Biomaterials Science and Engineering, Seoul National University, Seoul, 08826, Republic of Korea

 

通訊作者：Yun-Hoon Choung

 

Department of Otolaryngology, Ajou University School of Medicine, Suwon, 16499, Republic of Korea

Ajou University Graduate School of Medicine, Bk21 Plus Research Center for Biomedical Sciences, Suwon, 16499, Republic of Korea

 

通訊作者：Pankaj Garg

 

Research Institute for Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, Seoul, 08826, Republic of Korea

 

通訊作者：Jong Hoon Chung

 

Department of Biosystems Engineering, Seoul National University, Seoul, 08826, Republic of Korea

Research Institute for Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, Seoul, 08826, Republic of Korea

BK21 Global Smart Farm Educational Research Center, Seoul National University, Seoul, 08826, Republic of Korea

 

03原文信息

M.C. Lee, H. Seonwoo, K.J. Jang, S. Pandey, J. Lim, S. Park, J.E. Kim, Y.-H. Choung, P. Garg, J.H. Chung, 

Development of novel gene carrier using modified nano hydroxyapatite derived from equine bone for osteogenic differentiation of dental pulp stem cells, 

Bioactive Materials 6(9) (2021) 2742-2751.  

doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.01.020