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對藥品雜質(zhì)譜的控制是保證藥品安全有效的重要措施，也是提升國產(chǎn)藥品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

自2010 年提出實(shí)施雜質(zhì)譜控制的基本策略以來，經(jīng)近十年持續(xù)的努力, 國內(nèi)已經(jīng)形成了一個比較成熟的藥品雜質(zhì)譜控制體系。

筆者曾對2010年之前、2010~2015 年間化學(xué)藥品雜質(zhì)譜控制的進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

2015 年以來，該領(lǐng)域在雜質(zhì)譜控制理念、分析技術(shù)及技術(shù)應(yīng)用等方面均得以迅速發(fā)展，因此本文綜述2015 年以來化學(xué)藥品雜質(zhì)控制的進(jìn)展情況，并闡述亟待解決的問題和發(fā)展前景。

對藥物雜質(zhì)譜（impurity profile）的控制是保證藥品安全性的重要環(huán)節(jié)，也是目前國內(nèi)新藥研發(fā)的關(guān)鍵制約因素。

與雜質(zhì)譜控制相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)問題可概括為：復(fù)雜體系樣本的分離分析、微量組分的結(jié)構(gòu)分析和微量組分的毒性評價三個方面[1]。

理想的“雜質(zhì)譜控制(impurity profiling)”理念應(yīng)針對藥品中的每一個雜質(zhì)，依據(jù)其生理活性制定相應(yīng)的質(zhì)控限度。

在國家重大新藥創(chuàng)制等項目的支持下，近年來國內(nèi)雜質(zhì)譜控制技術(shù)得以迅速發(fā)展。

作者曾對2010—2015 年間化學(xué)藥品雜質(zhì)譜的研究進(jìn)展進(jìn)行過綜述[2]，本文綜述了2015 年以來化學(xué)藥品雜質(zhì)譜研究的進(jìn)展。

1法規(guī)、指導(dǎo)原則與應(yīng)用

人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）在制訂的原料藥、制劑雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則（ICH Q3A，ICH Q3B），殘留溶劑研究指導(dǎo)原則（ICH Q3C）和元素雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則（ICH Q3D）的基礎(chǔ)上，2014 年又頒布了基因毒性雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則[Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities inPharmaceuticals to limit Potential Carcinogenic Risk，ICH M7 (R1)]，進(jìn)一步指導(dǎo)創(chuàng)新化學(xué)藥研發(fā)中的雜質(zhì)研究。

雖然ICH 的指導(dǎo)原則對新藥注冊時藥品中的各類雜質(zhì)有了明確的要求，但如何將指導(dǎo)原則與具體的研發(fā)實(shí)踐相結(jié)合仍有諸多問題需要探討。

藥品中的雜質(zhì)可能來源于原料合成中的起始物、溶劑、催化劑、中間體、副產(chǎn)物等工藝過程，也可能在制劑生產(chǎn)、貯存和使用過程中產(chǎn)生。

從藥品的研發(fā)至產(chǎn)品上市通常要經(jīng)歷較長的時間，不同研發(fā)階段的關(guān)注重點(diǎn)應(yīng)有所不同，且人們對產(chǎn)品中雜質(zhì)的認(rèn)識也是伴隨著對產(chǎn)品工藝、生產(chǎn)、貯存的不斷認(rèn)知而深入了解。

然而，目前僅美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）針對新藥不同研發(fā)階段雜質(zhì)研究的關(guān)注點(diǎn)進(jìn)行過原則性地討論。

Olsen 等[3]對此進(jìn)行了綜述。

對于工藝雜質(zhì)，應(yīng)在原料合成階段重點(diǎn)關(guān)注產(chǎn)品中可能出現(xiàn)的各類潛在雜質(zhì)；當(dāng)最終合成路線確定后應(yīng)重點(diǎn)分析雜質(zhì)的去除途徑，確定生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)；隨著工藝過程的不斷成熟，再開展未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確認(rèn)工作，并開發(fā)新的分析方法確定是否有潛在雜質(zhì)的存在。

對于手性雜質(zhì)，通常需從合成工藝的角度控制各類手性異構(gòu)體的產(chǎn)生。

在新藥研發(fā)的早期，雜質(zhì)的水平與產(chǎn)品的毒理學(xué)安全性評價結(jié)果相匹配；當(dāng)新藥進(jìn)入臨床研究階段，產(chǎn)品中的雜質(zhì)限度可以按ICH 的要求進(jìn)行控制，也可以基于臨床暴露劑量和毒理學(xué)結(jié)果適度調(diào)整；有時根據(jù)內(nèi)控的安全警戒線，雜質(zhì)的鑒別閾值和界定閾值可以調(diào)整至ICH Q3 的3倍，并隨著臨床暴露劑量的變化進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整[4]；當(dāng)進(jìn)入III 期臨床時，產(chǎn)品應(yīng)符合ICH 的要求。

ICH M7 (R1) 對藥品中的基因毒性雜質(zhì)（mutagenic impurities, MIs）已經(jīng)有明確的控制要求，依據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)，最大的日攝入量為1.5 μg。

最初人們普遍認(rèn)為在臨床試驗(yàn)階段也需要將MIs 控制在TTC 水平，但TTC 是基于“終身暴露時間（life time exposure）”（通常為75 年）設(shè)定的，而早期臨床研究的暴露時間通常< 30 天。

業(yè)界很快就認(rèn)識到這一規(guī)定缺乏科學(xué)性，并提出分階段達(dá)到TTC 的建議[5]。

盡管ICH M7 (R1)已經(jīng)允許在周期較短的臨床試驗(yàn)中對MIs的控制可適度放寬，但這一選項并未被充分利用，而更多的是選擇默認(rèn)的TTC限度[6]。

這也不同程度的制約了新藥研發(fā)的進(jìn)程。

雜質(zhì)界定（qualification）是雜質(zhì)譜控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

由于缺少有效的界定方法，通常建議在允許的情況下應(yīng)盡可能地控制雜質(zhì)水平以符合ICH 的要求。

應(yīng)特別關(guān)注文獻(xiàn)中是否已有足夠的數(shù)據(jù)證明已知雜質(zhì)的安全性。

對特定的雜質(zhì)是否需要進(jìn)行界定，不僅取決于患者每日的攝入劑量，而且還與藥品的適應(yīng)癥、給藥途徑、服用時間等因素有關(guān)。

雖然在新藥研發(fā)中對雜質(zhì)進(jìn)行充分的研究是藥品注冊的基本要求，但對已知和潛在雜質(zhì)的界定應(yīng)分階段進(jìn)行。

Shaikh 等[7]從確?；颊甙踩慕嵌?，提出了新藥研發(fā)中進(jìn)行雜質(zhì)界定的決策樹（圖1）：

①力爭將雜質(zhì)水平控制在ICH 的各種閾值以下；

②對含量大于鑒別限的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)果判斷其可能的臨床風(fēng)險；

③對含量大于界定限的雜質(zhì)，評估其導(dǎo)致臨床中發(fā)生不良反應(yīng)的可能；

④對含量大于鑒定限的雜質(zhì)，應(yīng)根據(jù)ICH M7 的要求進(jìn)行基因毒性的評估。

各種烷基磺酸酯類雜質(zhì)目前普遍被各國監(jiān)管部門認(rèn)為是磺酸鹽類藥物中的潛在基因毒性雜質(zhì)，推測其在合成過程中與乙醇等低級醇發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生，因而要求企業(yè)必需對產(chǎn)品中是否可能殘留有相應(yīng)的烷基酯進(jìn)行全面驗(yàn)證。

然而Snodin 等[8]依據(jù)烷基磺酸酯的反應(yīng)機(jī)制和實(shí)驗(yàn)證據(jù)，認(rèn)為合成工藝中形成的磺酸酯不可能達(dá)到具有顯著毒理學(xué)意義水平：從熱力學(xué)角度，磺酸鹽在醇中的酯化反應(yīng)極難發(fā)生，需在強(qiáng)酸性條件下才能發(fā)生少量的轉(zhuǎn)化；在乙醇溶劑中，加入與藥物堿基等摩爾的磺酸根后，二者即刻成鹽，進(jìn)而阻止了磺酸酯的形成；雖然合成中更易形成氯代烷烴，但氯代烷烴極易被清除，且其在生物體內(nèi)的烷基化作用較磺酸酯弱很多，根據(jù)現(xiàn)有的毒理學(xué)數(shù)據(jù)和ICH M7(R1)的規(guī)定，采用磺酸酯的安全限量控制氯代烷烴也是不科學(xué)的。

因此，監(jiān)管部門對磺酸鹽相關(guān)工藝管理方式的科學(xué)性應(yīng)重新進(jìn)行評估?？贵w偶聯(lián)藥物(antibody-drug conjugates, ADCs)作為一種新興的藥物，目前ICH Q3A、Q3B和Q6B(質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：生物技術(shù)產(chǎn)品/生物制品的試驗(yàn)程序和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn))的相關(guān)規(guī)定均不能完全滿足對其中小分子雜質(zhì)的控制要求。

國際藥物研發(fā)創(chuàng)新與質(zhì)量聯(lián)盟(The International Consortium for Innovation and Quality inPharmaceutical Development, IQ)成立專門的工作組(IWG)對該問題進(jìn)行討論[9]。

基于風(fēng)險評估的方法，基于ADCs中小分子雜質(zhì)的分子量、與蛋白載體的結(jié)合特性、ADC的給藥濃度和給藥方式等，提出了ADC中小分子雜質(zhì)的安全性評估策略和構(gòu)建ADC質(zhì)量控制體系的方案。

ADCs中的小分子雜質(zhì)不管是否已與蛋白載體結(jié)合均應(yīng)進(jìn)行控制；通過對ADC結(jié)合工藝的控制，減少雜質(zhì)與載體蛋白的結(jié)合；通過對后續(xù)純化工藝的控制，保證對游離雜質(zhì)及藥物的有效去除，使之滿足ICH Q3A的一般要求；通過ADC藥物穩(wěn)定性的評估，預(yù)測制劑中游離小分子雜質(zhì)是否能滿足ICH Q3B的要求。

評價結(jié)果提示，ADC中的小分子雜質(zhì)含量通常非常低，基本不會導(dǎo)致臨床安全風(fēng)險。

對仿制藥技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)是藥物研發(fā)的另一熱點(diǎn)。

2018 年10 月18 日美國FDA 向ICH 提議協(xié)調(diào)全球仿制藥審評標(biāo)準(zhǔn)[10]：以提高全球仿制藥質(zhì)量的一致性；提高監(jiān)管監(jiān)督效率并降低監(jiān)管成本；擴(kuò)大全球仿制藥市場規(guī)模，通過競爭降低仿制藥研發(fā)的成本，最終使患者受益。

2019 年2 月6 日，ICH 發(fā)布了對此問題的思考[11]：認(rèn)為雖然許多ICH 指南適用于仿制藥，但建立協(xié)調(diào)一致的仿制藥注冊標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義，并將在2019 年組建仿制藥討論組（Informal Generic DrugDiscussion Group, IGDG）對其可行性進(jìn)行評估。

2015 年8 月18 日，國務(wù)院印發(fā)的《關(guān)于改革藥品醫(yī)療器械審評審批制度的意見》，將“提高仿制藥質(zhì)量，加快仿制藥質(zhì)量一致性評價”作為我國改革藥品審評審批制度的五大目標(biāo)之一；以2016年3 月5 日國務(wù)院辦公廳發(fā)布的《關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價的意見》為節(jié)點(diǎn)，國內(nèi)以生物等效為目標(biāo)的口服制劑一致性評價工作蓬勃開展；2017 年12 月，CDE 一致性評價辦公室又發(fā)布了《已上市化學(xué)仿制藥（注射劑）一致性評價技術(shù)要求（征求意見稿）》，揭開了注射劑仿制藥一致性評價的大幕。

雜質(zhì)研究一直是仿制藥一致性評價中審評的重點(diǎn)。

鑒于仿制藥與參比制劑生產(chǎn)工藝的差異，二者的雜質(zhì)譜可能不完全相同。

雖然按新仿制藥的一般要求，對參比制劑中不存在的“新雜質(zhì)”原則上要按照ICH 的要求進(jìn)行控制，對各國藥典已經(jīng)收載的“已知雜質(zhì)”原則上要進(jìn)行鑒別與比較。

但進(jìn)行一致性評價的國產(chǎn)制劑通常在臨床中已應(yīng)用了較長時間，歷年的藥物不良反應(yīng)信息可以在一定程度上揭示仿制藥的安全信息。

如何基于風(fēng)險控制理念，形成我國仿制藥一致性評價中的雜質(zhì)評估/控制策略，是業(yè)界和監(jiān)管部門面臨的新挑戰(zhàn)。

2雜質(zhì)譜分析技術(shù)進(jìn)展

伴隨著對原料藥和制劑中各種工藝雜質(zhì)(包括基因毒性雜質(zhì))和降解產(chǎn)物監(jiān)管要求的不斷提高，對痕量水平雜質(zhì)的表征和分析在藥物雜質(zhì)譜分析中越來越受到重視。

各類分析儀器的發(fā)展，特別是GC-MS、LC-MS、CE-MS、SFC-MS、LC-NMR、CE-NMR、LC-FTMS 等聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，可實(shí)現(xiàn)在線對含量在~0.1%水平的雜質(zhì)進(jìn)行快速分析。

近年來，對已知雜質(zhì)的快速識別策略已經(jīng)相當(dāng)完善[3,12]；利用在線或離線的HPLC-MS 和/或HPLC-NMR 技術(shù)，或樣品不經(jīng)分離直接進(jìn)行NMR 分析并結(jié)合光譜分析，對未知雜質(zhì)和降解物快速進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)也取得較大進(jìn)展；基因毒性雜質(zhì)（MIs）和手性藥物對映體的分析檢查也受到高度重視[12]。

2.1 MIs 分析

Teasdale 等[6]對ICH M7 實(shí)施以來MIs 的分析進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述：新的分析方法更注重對一類而不是單一的MIs 進(jìn)行分析，方法開發(fā)除要求具有更高的靈敏度和專屬性外，還應(yīng)盡量減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

氣相色譜法(GC)是分析具揮發(fā)性MIs 的首選方法，高效液相色譜法(HPLC)用于對非揮發(fā)性MIs 的分析；可以通過衍生化等方法改善MIs 的揮發(fā)性和穩(wěn)定性；采用頂空進(jìn)樣方式可以有效避免基質(zhì)效應(yīng)，使得更易方法開發(fā)。

已有綜述詳細(xì)論述了系統(tǒng)分析MIs 的一般策略與方法[13, 14]。

Sun 等[15]基于MIs 的揮發(fā)性，從避免基質(zhì)干擾的角度提出了選擇MIs 分析方法的決策樹（圖2），并用于探討穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中易形成基因毒性雜質(zhì)的常見降解途徑，用以指導(dǎo)藥物的研發(fā)與審批[16]。

HILIC（親水相互作用色譜法）作為其他色譜技術(shù)特別是GC 的互補(bǔ)方法，常用于替代GC 對極性MIs 進(jìn)行分析。

McCalley[18]對HILIC 的分離機(jī)制進(jìn)行了綜述，可指導(dǎo)方法的開發(fā)。

采用HILIC-UV 法測定達(dá)伐吡啶（dalfampridine）中5 種潛在的芳香胺類MIs，其中，色譜柱的選擇是關(guān)鍵：Zorbax 硅膠柱（5 μm）能給出理想的分析結(jié)果，其他HILIC 柱如兩性柱（ZIC-HILIC 柱）或腈基柱（nitrile-HILIC 柱）的峰形較差，離子對試劑可導(dǎo)致方法的回收率變差；而C8或C18 色譜系統(tǒng)的選擇性較差[18]。

利用ZIC-pHILIC 親水作用色譜柱，采用CAD或NQAD 檢測器，在含TFA 流動相中可對12 種不具紫外吸收的堿性MIs 包括已知致癌物肼（hydrazine）進(jìn)行測定[19]。

Denton 等[20]利用HILIC 實(shí)現(xiàn)了對微量氯丙二醛（2-chloromalonaldehyde）的分析。

Douša 等[21]利用HILIC-MS 方法分析沃替西?。?vortioxetine ） 中微量的二(2- 氯乙基) 胺[2-chloro-N-(2chloroethyl)ethanamine]。

衍生化技術(shù)可以進(jìn)一步提高M(jìn)Is 分析的靈敏度。

Grinberg 等在乙腈中以吡啶為衍生化試劑，對美托洛爾起始原料中的硫酸二甲酯(dimethyl sulfate, DMS)進(jìn)行衍生化處理，分析衍生化產(chǎn)物N-甲基吡啶；采用HILIC-ESI-MS 的SIM 檢測模式，DMS 的線性范圍為0.05~10 ppm，LOD 和LOQ分別為0.4 和1 ppm[22]；利用新型的衍生化試劑BPPC [butyl-1-(pyridine-4-yl)piperidine-4-carboxylate]，采用HILIC-MS/MS 方法，可作為API 中烷基鹵化物和烷基磺酸鹽的常規(guī)分析方法或篩查方法，前者的檢測水平為0.1 ppm，后者為1ppm，且方法不易受基質(zhì)的干擾[23]。

離子色譜法雖然常作為 GC-MS 或HPLC-MS 的輔助技術(shù)，用于分析強(qiáng)極性的MIs 如烷基氯化物（alkyl chlorides）、肼等，但近年來的進(jìn)展較小[6]。

Frenzel等[24]對離子色譜分析中常用的膜凈化方法進(jìn)行了綜述；采用在線固相萃取技術(shù)，測定甲磺酸雷沙吉蘭中的痕量羥胺：樣品溶液中的甲磺酸雷沙吉蘭被截留在IonPac CG12A 固相萃取柱上，羥胺進(jìn)入色譜測定單元（CG12A 保護(hù)柱、CS12A分析柱、安培檢測器）；方法的LOD 和LOQ 分別為0.02 和0.04 μg·mL-1 [25]。

超臨界色譜（SFC）也常作為HPLC 的互補(bǔ)方法。

Lesellier 和Westd 對近年來SFC的技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行了綜述[26]。

以超臨界二氧化碳為流動相，甲醇為極性改性劑，采用兩種不同的苯基柱(Synergi polar RP 和Cosmosil 5PBB)，比較SFC 對多環(huán)芳烴(PAHs)分離的選擇性：發(fā)現(xiàn)PAHs 在SFC 和HPLC 中的保留行為不同；改性劑甲醇的濃度對MIs 在Synergi polar RP 柱的分離影響較大，但對Cosmosil 柱的分離影響較小[27]。

比較SFC-ELSD 和HPLC-ELSD 分析PVC 塑料中的塑化劑（ATBC、DEHA、DEHT、TOTM），SFC-ELSD 的靈敏度更高，但HPLC-ELSD的精密性更好[28]。

毛細(xì)管電泳(CE)及電色譜技術(shù)對極性樣品具有良好的分離選擇性，雖然其靈敏度較低，通常不宜用于MIs 分析；但CE 的載樣量高，間接紫外檢測的檢測限可達(dá)2 ~ 3 ppm；作為HPLC 的互補(bǔ)分離技術(shù)，在分析原料藥中磺酸基、肼/烷基胺、疊氮化物、硫酸二甲酯和氯乙酰等PMIs 中均有應(yīng)用[6]。

硼酸及相關(guān)酯類作為新的MIs，主要在一些高效偶聯(lián)反應(yīng)如鈴木-宮浦(Suzuki-Miyaura) 反應(yīng)中產(chǎn)生。

由于硼酸類MIs 可以通過對硼元素的測定，再通過化學(xué)計量關(guān)系得到其含量，因此，利用ICP-MS 和硼靶對樣品中的殘留硼進(jìn)行測定，不僅靈敏度高（LOQ 為0.8 ppm，限度值為40 ppm），選擇性好，且可避免常見的基質(zhì)干擾。

Patel 等[29]對該方法的參數(shù)設(shè)置及優(yōu)化中常見的問題進(jìn)行了綜述。

對烷化劑類MIs 的測定常采用GC-MS 或HPLC-MS（經(jīng)衍生化處理）方法，但鑒于ICP 對硫和鹵素元素的測定已達(dá)到ppb 級，這為烷化劑的分析提供了新的解決方案[30]。

利用HPLC-ICP-MS 分析烷基化劑4-氯-1-丁醇，采用3-碘苯甲酰試劑進(jìn)行衍生化，方法的LOD和LOQ分別為0.2 和0.5 ppm，線性范圍(μg·g-1API)為0.5~50 ppm，1~50 ppm 的準(zhǔn)確性為95.1% ~ −114.7%，重復(fù)性（RSD）為6.2%[31]。

采用相同的方法測定烷化劑苯肼可得到相似的結(jié)果，如采用三碘代衍生物試劑，可提高方法的靈敏度，LOD 和LOQ 分別為0.06 和0.2 ppm[32]。

2.2 元素雜質(zhì)分析

各類元素雜質(zhì)可能在藥品生產(chǎn)的諸環(huán)節(jié)中被無意引入終產(chǎn)品對患者造成危害。

ICH Q3D 建議對藥品中的元素雜質(zhì)應(yīng)進(jìn)行定性和定量限制，藥品中各類元素雜質(zhì)的可接受的每日接觸量(permissible daily exposure, PDE)限度與給藥途徑有關(guān)，USP 在新頒布的通則<232>中對藥品中的24 個元素雜質(zhì)提出了明確的質(zhì)控要求（表1），目前國內(nèi)藥物研發(fā)的相關(guān)法規(guī)政策也正逐漸向ICH 靠攏。

通常藥品終產(chǎn)品中殘存的痕量或超痕量的 Ir、Os、Pd、Pt、Rh 和Ru 等元素雜質(zhì)，可能與原料合成中使用的催化劑有關(guān)；Cd、Hg、Ni、Pb 等元素雜質(zhì)可能通過生產(chǎn)中的水和溶劑、合成試劑、輔料（穩(wěn)定劑、填充劑、粘合劑、顏料、香料和涂料）等途徑污染藥物；而Cr、Cu、Mo、Ni、V 等元素雜質(zhì)可能與制造過程中產(chǎn)品與混合罐、過濾器、填充線、包裝容器等表面的接觸污染產(chǎn)品[33]。

enke等[34]對由藥品生產(chǎn)和包裝環(huán)節(jié)引入元素雜質(zhì)的風(fēng)險進(jìn)行了綜述。

與藥物接觸的各類生產(chǎn)線、包裝容器等材料，與藥品接觸時通常只有微量的元素實(shí)體可轉(zhuǎn)移至藥品中。

因此，雖然某些元素雜質(zhì)在自然環(huán)境中普遍存在，但經(jīng)制藥過程和包裝材料引入藥品的風(fēng)險并不高。

Boetzel 等[35]介紹了一個由制藥公司聯(lián)盟整理的包括201 種輔料、26 723 個檢測數(shù)據(jù)的元素雜質(zhì)數(shù)據(jù)庫，是目前同類數(shù)據(jù)庫的佼佼者，且仍在迅速擴(kuò)大，可用于藥品的風(fēng)險評估。

Paskiet 等[36]對注射劑從常用的密封橡膠實(shí)體引入元素雜質(zhì)的風(fēng)險進(jìn)行了評估。

電感耦合等離子體-質(zhì)譜法(ICP-MS)是目前測定元素雜質(zhì)的最常用手段，其次是電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)，它們均可在多類樣品基質(zhì)中同時檢測多種元素雜質(zhì)；當(dāng)僅對一種或幾種特定元素雜質(zhì)如Hg,、As 和Cr 進(jìn)行測定時，傳統(tǒng)的原子吸收光譜法(AAS)也可得到理想的分析結(jié)果[33]。

Wollein 等[37]采用ICP-MS、電感耦合等離子體-發(fā)射光譜法(ICP-OES)和原子吸收光譜法(GFAAS, CVAAS, HGAAS)，對市場中113 個樣品的21 種金屬雜質(zhì)進(jìn)行了分析，Li 等[38]綜述了31 種190 個藥用輔料樣品元素雜質(zhì)的檢測方法及測定結(jié)果，ICP-MS 特別適用于對日攝入量高的注射劑和吸入制劑中微量元素雜質(zhì)的測定，定量精密度（RSD）小于4.5%；ICP-OES 的操作較簡單且具有較快的分析速度，通?？捎糜谠牧虾涂诜苿┲械脑仉s質(zhì)分析；兩種分析技術(shù)的測定結(jié)果均可滿足USP 通則<232>的要求[33, 37]。

Menoutis 等[39]采用超聲霧化(UN)軸向電感耦合等離子原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）測定微量的一類和二類元素雜質(zhì)，較常規(guī)ICP-MS 分析具有更低的檢出限。

Balaram[40]對各類儀器分析方法包括便攜式儀器、原子吸收光譜法(AAS)、X-射線熒光光譜分析(XRF)法、儀器中子活化分析(INAA)法、ICP-AES 和ICP-MS 的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

采用微波輔助消解(MWAD)技術(shù)對樣品進(jìn)行前處理是元素雜質(zhì)分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

USP 通則< 233 >給出了兩種通用方法，分別用于ICP-AES 分析和ICP-MS分析。

Jin[41]對元素雜質(zhì)分析樣本前處理中的常見污染途徑進(jìn)行了綜述，對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、試劑和器皿的控制是保證測定結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。

Muller 等[42]通過比較濃硝酸、王水（aqua regia）和逆王水（inverse aqua regia）對4 種原料藥的微波消解效率，發(fā)現(xiàn)硝酸和逆王水較理想，前者可有效消解500 mg 樣品，后者適用于250 mg 以下樣品的消解，所有的測定元素(除Os 元素易形成OsO4 影響回收外)均有較好的回收率(91% ~ 109%)；da Silva 等[43]利用逆王水建立了適用于采用ICP-OES 和ICP-MS 快速分析As、Cd、Hg、Pb 的簡單微波輔助消解方法；Paskiet等[36]比較了多種對合成橡膠中元素雜質(zhì)的提取方法。

2.3 浸出物/萃取物分析

藥品中的浸出物一般認(rèn)為是在常規(guī)或加速條件下，從與藥物接觸的實(shí)體（包裝材料、注射器、輸液管等）中遷移至藥品中的化學(xué)物質(zhì)；對藥品中各類浸出物的分析屬于雜質(zhì)譜分析的一部分。

而萃取物一般認(rèn)為是在實(shí)驗(yàn)室受控萃取研究中從試驗(yàn)品釋放到萃取介質(zhì)中的化學(xué)物質(zhì)。

萃取物包括各類揮發(fā)性、半揮發(fā)性、非揮發(fā)性的有機(jī)和無機(jī)化合物，開展受控萃取研究是希望了解藥品真實(shí)的浸出物譜，進(jìn)而評估各類浸出物的安全風(fēng)險[44]。

理想的情況是按照質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）的理念，依據(jù)藥品的組成、包裝系統(tǒng)的組成與型狀、與藥物的接觸情況等，評估得到在生產(chǎn)及貯存過程藥品中浸出物的安全空間；Jenke以塑料包裝的注射液為例，論證了該理念的可行性[45]。

從藥用聚合物材料萃取物中鑒定出的540 余種化合物的毒理學(xué)信息包括未觀察到作用的水平(no observed effect levels, NOELs)、未觀察到有害作用的水平(no observed adverse effect levels, NOAELs) 、公布的最低中毒劑量(lowestpublished toxic dose, TDLOs)等毒理學(xué)終點(diǎn)指標(biāo)已被匯總，可用于浸出物的風(fēng)險評估[46]；由一個非營利性聯(lián)合體-產(chǎn)品質(zhì)量研究所(PQRI)設(shè)立的浸出物/萃取物工作小組，對藥品研發(fā)過程中與浸出物/萃取物有關(guān)的科學(xué)和管理問題進(jìn)行了探討，目前已在浸出物/萃取物分析的標(biāo)準(zhǔn)化工作程序和安全閾值等方面達(dá)成共識，且分別用于對口腔吸入劑、鼻腔制劑、注射劑、眼用制劑中的浸出物的風(fēng)險評估[47,48]。

采用水和有機(jī)萃取溶劑對生產(chǎn)注射劑包裝袋的21 種常用聚丙烯樹脂進(jìn)行萃取研究，并根據(jù)萃取物譜評估其對注射劑長期、大劑量治療時的潛在風(fēng)險[49]。

雖然由于處方工藝的差異，在不同萃取條件下不同的聚丙烯樹脂的有機(jī)萃取物譜差異較大，但依據(jù)特定的萃取成分如抗氧劑等可將其分為不同的組，同組樣品的萃取物譜具有相似性；大多數(shù)萃取液中元素雜質(zhì)（鋁、硅、堿金屬和堿土金屬）的量均較低。

浸出物/萃取物分析的另一關(guān)鍵點(diǎn)是如何保證所有浸出/萃取出的物質(zhì)都得到檢出。

色譜法是常用的分析方法。

Jenke 等[50]采用互補(bǔ)的色譜系統(tǒng)如GC 和HPLC結(jié)合多種檢測方式，分析藥物包裝、生產(chǎn)和釋藥系統(tǒng)等常用的塑料材料中的萃取物譜，為防止色譜分析中遺漏了某些萃取物，利用總有機(jī)碳含量(TOC)測定法評估對各類水提物（包括緩沖液提取物）分析結(jié)果的完整性，并在對無菌濾器水提物等的分析中得到了較好的應(yīng)用。

對提取物中不適合用GC 進(jìn)行分析的非揮發(fā)性及熱不穩(wěn)定化合物，在由大氣化學(xué)電離質(zhì)譜結(jié)合紫外檢測器組成的UPLC 系統(tǒng)中，22 min 即可實(shí)現(xiàn)對多種常見提取物中的代表性化合物混合物進(jìn)行充分的分離與檢測，在對實(shí)際萃取樣品進(jìn)行分析時，即使分析對象是不相容的有機(jī)萃取液，也不會對色譜系統(tǒng)產(chǎn)生顯著影響[51]。

通過模擬浸出(遷移)試驗(yàn)（由低密度聚乙烯瓶、聚丙烯瓶蓋和膠塞等組成、萃取溶劑分別為pH 2.5 的緩沖溶液、pH9.5 的緩沖溶液和體積比1:1 的異丙醇/水），揭示注射劑和滴眼劑包材的浸出物譜。

包材的萃取物譜與包材的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，且受萃取介質(zhì)和具體浸出物化學(xué)性質(zhì)的影響；雖然藥物與包材直接接觸可能加速某些浸出物的遷移，但并不是發(fā)生遷移和浸出的先決條件[52]。

膠塞中的析出物與頭孢菌素相互作用，導(dǎo)致貯存過程中藥品溶解時逐漸變渾濁是國內(nèi)突出的質(zhì)量問題[53]。

利用GC-MS 建立的膠塞揮發(fā)性成分分析數(shù)據(jù)庫，不僅可以快速分析常用膠塞中的主要揮發(fā)性遷移物，還可以快速確認(rèn)易與頭孢菌素相互作用的遷移物；結(jié)合模擬吸附試驗(yàn)，可形成有效的頭孢菌素-膠塞相容性試驗(yàn)策略，進(jìn)而針對性地建立膠塞質(zhì)控方法[54]。

2.4 AQbD 理念及應(yīng)用

風(fēng)險管理理念與質(zhì)量保證體系的緊密結(jié)合是保證藥品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。

雜質(zhì)譜控制過程中，保證雜質(zhì)質(zhì)控分析方法在整個藥品生命周期都具有良好的專屬性和敏感性。

分析方法質(zhì)量源于設(shè)計（analytical quality bydesign, AQbD）理念作為一種面向風(fēng)險管理的方法論，近年來在建立雜質(zhì)譜分析方法時被廣泛接受。

與傳統(tǒng)的質(zhì)量源于檢測（quality by testing, QbT）方法相比較，其根據(jù)分析目標(biāo)的變化范圍（analytical target profile, ATP），利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計（DoE）的方法，同時考慮管理與分析方法的風(fēng)險來確定設(shè)計空間（design space,DS），可最大程度的保證方法的有效性[55, 56]。

采用AQbD 理念建立的分析方法，由于允許實(shí)驗(yàn)參數(shù)在操作設(shè)計區(qū)域(method operable design region, MODR)內(nèi)變化，方法具有更好的粗放性，可減少實(shí)驗(yàn)中的超出趨勢結(jié)果（out of trend, OOT）和超出標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果（out of specification, OOS）[57]；

同時，由于可最大限度地減少在方法轉(zhuǎn)移（transfer）、性能確認(rèn)（verification）和方法變更中的工作量，有助于降低對分析方法生命周期管理包括方法設(shè)計、方法開發(fā)和方法驗(yàn)證（儀器的檢定、持續(xù)的方法性能驗(yàn)證和方法轉(zhuǎn)移）的成本[58]。

Dispas 等[56]對近年來AQbD 在雜質(zhì)譜分析中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

在基于AQbD 理念的HPLC 方法開發(fā)中，化學(xué)計量學(xué)方法在確定適宜的設(shè)計方案篩選關(guān)鍵影響因子，建立定量關(guān)系模型確定方法的操作空間等方面，發(fā)揮著越來越重要的作用（圖3）[59]。

Tumpa 等[60]提出了基于QbD 的理念建立HILIC 方法的指導(dǎo)原則；Zhang 等[61]利用混合過程變量（mixture-process variable, MPV）設(shè)計，建立了基于QbD 理念的HPLC 雙梯度洗脫分析方法，用于氯唑西林穩(wěn)定性試驗(yàn)中降解雜質(zhì)的測定；Taheri 等[62]在對塞來昔布（celecoxib）共洗脫物的半制備分離中，利用中心復(fù)合設(shè)計成功的選擇出最佳色譜分離條件。

對利用 HPLC-MS/MS 等聯(lián)用技術(shù)建立的可同時測定幾十至幾百種目標(biāo)分析物的分析方法，如對殘留農(nóng)藥等的測定，按傳統(tǒng)的方法驗(yàn)證要求，通常需要采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對定量準(zhǔn)確性等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

該驗(yàn)證程序不僅費(fèi)時、費(fèi)力；且當(dāng)目標(biāo)分析物變化如增加了新的控制對象時，需重新對方法進(jìn)行驗(yàn)證；實(shí)驗(yàn)中如對照品的加入量不適宜，還可能得到不正確的驗(yàn)證結(jié)果。

Alladio 等[63]利用化學(xué)計量學(xué)方法，建立了對新目標(biāo)分析物的保留時間、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、LOD 和LOQ進(jìn)行預(yù)測的偏最小二乘法模型，用于評價已有方法對新目標(biāo)分析物的分析能力，并取得了預(yù)期的評價效果。

利用定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)不僅可以預(yù)測分析物的保留時間，且有助于對其分離機(jī)制的了解。

對未知組分保留值的預(yù)測可以幫助選擇分析方法，減少方法開發(fā)的時間。

Amos 等[64]對建立QSRR 模型的方法、關(guān)鍵點(diǎn)和預(yù)測精度等進(jìn)行了綜述。

根據(jù)溶質(zhì)的色譜相似度指數(shù)（chromatographicsimilarity index）建立局部QSRR 模型可準(zhǔn)確預(yù)測溶質(zhì)的保留值[65]。

比較4 種常用的評價QSRR 模型預(yù)測準(zhǔn)確性的表征方法，認(rèn)為預(yù)測均方根誤差百分比(RMSEP)是對QSRR 模型預(yù)測能力的最佳估計值[66]。

利用定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)模型，通過預(yù)測分析物在5 種不同HILIC 固定相上的保留值，可以幫助選擇最適宜分離的固定相[67]。

利用定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)結(jié)合疏水消除模型(HSM)，預(yù)測分析物在反相液相色譜系統(tǒng)(RPLC)中的保留值，可以預(yù)測藥物雜質(zhì)是否與藥物活性成分（API）的共洗脫[68]。

當(dāng)缺乏雜質(zhì)對照品，無法判斷一個新建立的色譜方法是否可以對藥物中所有的已知雜質(zhì)都能檢出時，利用QSRR 模型，通過預(yù)測已知雜質(zhì)的保留時間，可以幫助判斷方法對已知雜質(zhì)的檢出能力[69]，并可以預(yù)測新雜質(zhì)的色譜行為[70]。

2.5 其他

選擇適宜的色譜柱依然是藥物雜質(zhì)譜分析的熱點(diǎn)。

不同色譜柱的選擇性差異，常導(dǎo)致無法重現(xiàn)文獻(xiàn)甚至藥典中收載的成熟的雜質(zhì)分析方法。

因此，如何快速尋找到性能適宜的色譜柱常成為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵?；谑杷Ｐ偷纳V柱表征體系已在色譜柱的選擇包括選擇相似或互補(bǔ)的色譜柱，選擇最佳分離色譜柱中廣泛應(yīng)用[71]，并推動了色譜柱選擇模式的發(fā)展[72-74]。

基于疏水消除模型，發(fā)現(xiàn)影響β-內(nèi)酰胺類抗生素難分離雜質(zhì)對分離的關(guān)鍵色譜柱參數(shù)是柱參數(shù)A，并提出了參數(shù)A 的最佳區(qū)間[75]。

以克拉霉素雜質(zhì)分析為例，選擇適用于分離難分離雜質(zhì)對的色譜柱，提出了應(yīng)用疏水消除模型針對特定分析方選擇最佳色譜柱的策略[76]。

上述研究體現(xiàn)了色譜柱選擇理論在實(shí)用化方面取得的進(jìn)展，而通過分子模擬方法如分子動力學(xué)或蒙特卡羅方法，最大化地減少實(shí)驗(yàn)篩選過程是色譜柱選擇應(yīng)用研究的目標(biāo)[77]。

藥物雜質(zhì)譜分析中的另一關(guān)鍵點(diǎn)是對雜質(zhì)的檢測與定量。在對各類不具有UV吸收的樣品的分析中，基于氣溶膠（aerosol-based）檢測的各類通用性檢測器特別是電噴霧檢測器（charged aerosol detectors，CAD）和電化學(xué)檢測器發(fā)揮著越來越重要的作用。

雖然CAD檢測器被普遍認(rèn)為是一種質(zhì)量型檢測器，可以在沒有對照品的情況下實(shí)現(xiàn)對溶質(zhì)絕對含量的準(zhǔn)確估計，然而對50種具有廣泛物理化學(xué)性質(zhì)的化合物的HPLC-CAD測定結(jié)果表明，相對于傳統(tǒng)的質(zhì)量校正定量方法，通過估計檢測顆粒的相對表面積進(jìn)行校正，可得到更準(zhǔn)確的定量結(jié)果，特別是可以明顯提高對密度較高溶質(zhì)定量的準(zhǔn)確性（與NMR定量的平均誤差為5.8%）[78]。

在雜質(zhì)譜分析中利用雜質(zhì)對照品進(jìn)行定性與定量分析是最理想的方案，在藥典等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，雜質(zhì)對照品的使用也越來越普遍。

與此同時，對雜質(zhì)對照品的制備、供應(yīng)等全生命周期的管理要求也越來越嚴(yán)格[79]。

我國在2016年5月施行的《化學(xué)藥品新注冊分類申報資料要求（試行）》中，對不同注冊分類的藥品包括原料和制劑研制過程中使用的對照品（包括主成分對照品和雜質(zhì)對照品）需提供相關(guān)資料。

對于藥典對照品，不僅需提供批號、純度、說明書等詳細(xì)信息，還要提供來源證明；研制過程中如果使用了外購對照品或自制對照品，除需提供來源證明外，還需提供結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及含量標(biāo)定過程等信息。

如何協(xié)調(diào)各國監(jiān)管部們對雜質(zhì)對照品的要求，提高各類雜質(zhì)對照品的可及性是雜質(zhì)譜研究的另一關(guān)鍵點(diǎn)[80]

采用混合雜質(zhì)對照品進(jìn)行定性[80,81]，采用加校正因子的主成分自身對照法定量，是解決方案之一。當(dāng)雜質(zhì)與主成分的校正因子0.9~1.1，可直接采用主成分自身對照法計算含量；當(dāng)雜質(zhì)與主成分的校正因子相差較大時，利用校正因子消除雜質(zhì)響應(yīng)值差異對測定結(jié)果的影響。根據(jù)質(zhì)量平衡原理，利用HPLC-DAD結(jié)合ELSD和MS分析，可以保證校正因子測定的準(zhǔn)確性[82]。

然而，利用定量NMR結(jié)合HPLC分析是消除校正因子測定中由雜質(zhì)對照品含量不準(zhǔn)確引入的誤差的最方便有效途徑[83]。