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本文主要介紹了武漢華大智造科技有限公司研發(fā)的創(chuàng)新醫(yī)療器械“基因測(cè)序儀”的臨床前研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

 

一、基因測(cè)序儀的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)及組成

 

基因測(cè)序儀由主機(jī)、基因測(cè)序儀控制軟件（主機(jī)內(nèi)嵌集成，版 本號(hào)：V1）組成，其中主機(jī)包括主體架構(gòu)、操作系統(tǒng)主機(jī)、光學(xué)系統(tǒng)、XYZ-平臺(tái)、芯片平臺(tái)、氣液系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)、試劑存儲(chǔ)系統(tǒng)、電源系統(tǒng)、顯示系統(tǒng)。

 

二、基因測(cè)序儀各模塊主要功能

 

主體架構(gòu)為儀器提供固定支撐；操作系統(tǒng)主機(jī)負(fù)責(zé)儀器控制，數(shù)據(jù)采集與處理，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)功能；光學(xué)系統(tǒng)負(fù)責(zé)測(cè)序芯片熒光信號(hào) 圖像采集；XYZ-平臺(tái)實(shí)現(xiàn)測(cè)序芯片掃描需要的運(yùn)動(dòng)及自動(dòng)對(duì)焦功能；芯片平臺(tái)負(fù)責(zé)測(cè)序芯片與管路的連通、芯片的溫度控制及調(diào)平；氣液系統(tǒng)負(fù)責(zé)為儀器完成生化反應(yīng)提供必要流體及氣體支持；電子控制系統(tǒng)負(fù)責(zé)儀器電子系統(tǒng)的調(diào)度與控制；試劑存儲(chǔ)系統(tǒng)提供試劑存 儲(chǔ)的環(huán)境；電源系統(tǒng)提供儀器運(yùn)行需要的各種電源；顯示系統(tǒng)為實(shí) 現(xiàn)用戶交互顯示的界面；控制軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)儀器部件的檢測(cè)及儀器流 路的清洗和維護(hù)的功能，執(zhí)行不同類型測(cè)序流程（任務(wù)）、監(jiān)控儀器 的部件狀態(tài)及對(duì)儀器的配置。

 

三、基因測(cè)序儀的產(chǎn)品適用范圍

 

該產(chǎn)品采用聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序技術(shù)，在臨床上用于對(duì)來(lái)源于人體樣本的脫氧核糖核酸（DNA）進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)基因序列，這些基因序列變化可能導(dǎo)致疾病或疾病易感性。該儀器在臨床上僅限于與食品藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的體外診斷試劑以及軟件配合使用，不用于人類全基因組的測(cè)序或從頭測(cè)序。

 

四、基因測(cè)序儀的工作原理

 

基因測(cè)序儀采DNA納米球（DNA Nanoball，DNB）以及聯(lián)合探針錨定聚合（Combinatorial Probe Anchor Synthesis，cPAS）測(cè)序核心技術(shù)，使用一種經(jīng)過(guò)特殊表面修飾的規(guī)則陣列芯片，每個(gè)修飾位點(diǎn)僅固定一個(gè)DNA納米球，陣列芯片修飾位點(diǎn)的間距均一，可保證不同納米球的光信號(hào)不會(huì)互相干擾，從而提高信號(hào)處理的準(zhǔn)確性。通過(guò)儀器液路系統(tǒng)將測(cè)序試劑和帶有不同發(fā)光波長(zhǎng)的熒光標(biāo)記 探針泵入測(cè)序芯片流動(dòng)室，每個(gè)DNA納米球每個(gè)測(cè)序周期只結(jié)合一種熒光標(biāo)記物，再由激光器激發(fā)熒光基團(tuán)發(fā)光，不同熒光基團(tuán)所發(fā)射的光信號(hào)被互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(Complementary Metal Oxide Semiconductor, CMOS)相機(jī)采集。之后規(guī)則陣列芯片上的光信號(hào)經(jīng)過(guò)處理后由隨機(jī)軟件轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行處理，以獲取待測(cè)樣本的堿基序列信息。

 

五、基因測(cè)序儀的產(chǎn)品安全性指標(biāo)

 

1.基因測(cè)序儀安全要求：符合 GB 4793.1-2007、GB 4793.9-2013、YY 0648-2008 和 GB7247.1-2012 的要求；

2.基因測(cè)序儀電磁兼容要求：符合 GB/T 18268.1-2010 和 GB/T 18268.26-2010 的要求；

3.基因測(cè)序儀環(huán)境試驗(yàn)要求：符合 GB/T 14710-2009 中氣候環(huán)境 試驗(yàn) I 組，機(jī)械環(huán)境 I 組的規(guī)定。

 

六、基因測(cè)序儀的產(chǎn)品性能研究 

 

1.樣本類型的驗(yàn)證

 

對(duì)如下常見樣本類型進(jìn)行了驗(yàn)證，包括血清、血漿、福爾馬林 固定石蠟包埋（FFPE）、單細(xì)胞、宮頸脫落細(xì)胞。涵蓋對(duì)人基因組 DNA、細(xì)菌與病毒基因組 DNA 的檢測(cè)。 

 

2.變異檢測(cè)的研究

 

（1）檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）和插入缺失（InDel）時(shí)，采用基因測(cè)序儀對(duì)炎黃人類基因組參考DNA進(jìn)行測(cè)序，獲取100X深度的原始數(shù)據(jù)與hg19參考基因組進(jìn)行比對(duì)，然后進(jìn)行變異檢測(cè)，將變異結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行一致性分析，數(shù)據(jù)顯示對(duì)單核苷酸變異檢出準(zhǔn)確性為 91.75%；對(duì)插入缺失變異檢出準(zhǔn)確性為 93.93%；

 

（2）檢測(cè)無(wú)義突變、截短型移碼突變、2bp 以內(nèi)剪接突變、起始密碼子丟失、多聚 N（poly N）突變、純合缺失時(shí)，采用基因測(cè)序儀對(duì)炎黃人類基因組參考DNA 進(jìn)行測(cè)序，在6個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)中，基因測(cè)序儀檢測(cè)結(jié)果與Sanger檢測(cè)結(jié)果一致性100%；同時(shí)，在單個(gè)或多個(gè)外顯子缺失/重復(fù)類型突變檢測(cè)中，基因測(cè)序儀準(zhǔn)確檢出已經(jīng)公開確認(rèn)的外顯子缺失。

 

結(jié)論：基因測(cè)序儀可以對(duì) SNP、InDel、無(wú)義突變、截短型移碼 突變、2bp 以內(nèi)剪接突變、起始密碼子丟失、單個(gè)或多個(gè)外顯子缺 失/重復(fù)、polyN 突變、純合缺失的突變類型進(jìn)行檢測(cè)。

 

3.測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制的研究

 

采用基因測(cè)序儀（BGISEQ-50）檢測(cè)“測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國(guó)家參考品”，該測(cè)序儀的測(cè)序通量為 10.3Gb、序列數(shù)量為 257M，滿足測(cè)序通量大于 7.2Gb、序列數(shù)量大于160M的企業(yè)內(nèi)部數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求。

 

4.準(zhǔn)確度的研究

 

（1）采用“測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國(guó)家參考品”進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本分別檢測(cè)多次，比對(duì)準(zhǔn)確性在 99.06%-99.72%范圍，準(zhǔn)確度結(jié)果均符合要求。 

 

（2）采用“基因測(cè)序儀準(zhǔn)確度企業(yè)參考品”進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)同一個(gè)參考品檢測(cè)多次，比對(duì)準(zhǔn)確性在99.32%-99.46%范圍，準(zhǔn)確度結(jié)果 符合要求。

 

5.精密度的研究

 

（1）采用“測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國(guó)家參考品”進(jìn)行檢測(cè)，精密度結(jié)果符合要求。

 

（2）采用“基因測(cè)序儀精密度企業(yè)參考品”進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)同一個(gè)參考品檢測(cè)多次，變異系數(shù)（CV）在0.04%-0.07%范圍，精密度結(jié)果符合要求。

 

6.檢測(cè)的上/下限研究

 

（1）插入突變和缺失突變檢測(cè)的上/下限研究：選取炎黃人類基因組參考 DNA 進(jìn)行外顯子測(cè)序，過(guò)濾原始數(shù)據(jù)后與hg19參考序列進(jìn)行比對(duì)和InDel變異檢測(cè)分析。結(jié)果表明：基因測(cè)序儀對(duì)插入突變檢測(cè)上限為24bp，下限為1bp；對(duì)缺失突變檢測(cè)上限為 21bp，下限為1bp。

 

（2）突變頻率檢測(cè)的下限研究：FFPE 樣本中突變頻率越低越難檢出，越高越容易檢出，因此采用已知 FFPE 樣本中的 E746-A750 缺失突變進(jìn)行檢測(cè)下限研究。結(jié)果表明：基因測(cè)序儀對(duì)該類缺失的突變頻率檢測(cè)下限為 2%。

 

（3）GC 含量檢測(cè)的上/下限研究：選取炎黃人類基因組參考DNA進(jìn)行外顯子測(cè)序，過(guò)濾原始數(shù)據(jù)后進(jìn)行與hg19參考序列進(jìn)行比對(duì)，挑選出能與參考序列完全比對(duì)上的測(cè)序片段。結(jié)果表明：基因測(cè)序儀對(duì)GC含量檢測(cè)上限為 86%，下限為 10%。

 

（4）PolyN 檢測(cè)的上/下限研究：選取炎黃人類基因組參考DNA進(jìn)行外顯子測(cè)序，過(guò)濾原始數(shù)據(jù)后與hg19參考序列進(jìn)行比對(duì)，挑選出能與參考序列完全比對(duì)上的測(cè)序片段。結(jié)果表明：基因測(cè)序儀對(duì)PolyN的檢測(cè)上限為9bp，檢測(cè)下限為 5bp。

 

7.臨床應(yīng)用項(xiàng)目的研究

 

為評(píng)估基因測(cè)序儀在臨床檢測(cè)方面的性能，分別挑選了5類具有代表性的項(xiàng)目，其中人基因組DNA檢測(cè)包括染色體變異 [胎兒染 色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)項(xiàng)目、胚胎植入前染色體非 整倍體檢測(cè)項(xiàng)目] 、單核苷酸突變（EGFR/KRAS 基因突變聯(lián)合檢測(cè)項(xiàng)目）；病原體基因組 DNA 檢測(cè)包括病毒鑒定分型 [人乳頭瘤病毒 （16、18 型）核酸分型檢測(cè)項(xiàng)目] 、病毒耐藥基因位點(diǎn)（乙型肝炎 拉米夫定 rtL180M 位點(diǎn)突變檢測(cè)項(xiàng)目），研究?jī)?nèi)容包括提取方法、臨床應(yīng)用項(xiàng)目企業(yè)參考品的符合性、交叉反應(yīng)物和干擾物質(zhì)以及臨床樣本的研究。

 

（1）提取方法的研究 各應(yīng)用項(xiàng)目分別采用相應(yīng)的提取方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明，研究的提取方法均適合臨床項(xiàng)目的應(yīng)用。（注：提取方法的研究不適用 于胚胎植入前染色體非整倍體檢測(cè)項(xiàng)目）。

 

（2）企業(yè)參考品的符合性研究 各應(yīng)用項(xiàng)目分別采用各自的企業(yè)參考品（包括準(zhǔn)確度或陰/陽(yáng)性 參考品、特異性、重復(fù)性、精密度、檢測(cè)限參考品）進(jìn)行研究。結(jié) 果表明，檢測(cè)性能符合企業(yè)參考品要求。

 

（3）交叉反應(yīng)物質(zhì)和干擾物質(zhì)的研究各應(yīng)用項(xiàng)目分別驗(yàn)證了常見的不同濃度的交叉反應(yīng)物質(zhì)和干擾物質(zhì)。結(jié)果表明，不影響其在基因測(cè)序儀（BGISEQ-50）上的正常檢出。

 

（4）臨床樣本的研究各應(yīng)用項(xiàng)目分別采用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果符合要求。

 

8.儀器的局限性

 

（1）基因測(cè)序儀（BGISEQ-50）不用于人類全基因組的測(cè)序或從頭測(cè)序。

 

（2）目前該測(cè)序儀僅對(duì)胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)項(xiàng)目、胚胎植入前染色體非整倍體檢測(cè)項(xiàng)目、EGFR/KRAS 基 因突變聯(lián)合檢測(cè)項(xiàng)目、人乳頭瘤病毒（16、18 型）核酸分型檢測(cè)項(xiàng) 目和乙型肝炎拉米夫定 rtL180M 位點(diǎn)突變檢測(cè)項(xiàng)目的性能進(jìn)行了研究。但該儀器作為通用測(cè)序平臺(tái)，可進(jìn)一步在其上開發(fā)其他臨床檢測(cè)項(xiàng)目，這些項(xiàng)目與之配套使用時(shí)需進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，對(duì)應(yīng)的體外診斷試劑和軟件須得到食品藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。

 

七、基因測(cè)序儀的產(chǎn)品有效期和包裝研究

 

 武漢華大智造提供了有效期的驗(yàn)證報(bào)告，驗(yàn)證試驗(yàn)為加速老化試驗(yàn)，包括產(chǎn)品穩(wěn)定性和包裝完整性。根據(jù)有效期影響因素表，從合理可預(yù)見的最嚴(yán)格的應(yīng)用場(chǎng)景出發(fā)，對(duì)使用該產(chǎn)品的影響因素進(jìn)行壽命評(píng)估及測(cè)試，為保證使用者的安全和臨床應(yīng)用中檢測(cè)的準(zhǔn)確性，確定該產(chǎn)品有效期為7年。包裝經(jīng)環(huán)境試驗(yàn)驗(yàn)證，符合運(yùn)輸和貯存要求。

 

八、基因測(cè)序儀的軟件研究

 

該產(chǎn)品按照《醫(yī)療器械軟件注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》的要求，提交了軟件描述文檔和軟件版本命名規(guī)則聲明。軟件完整版本號(hào)由四部分組成，軟件版本命名規(guī)則遵循風(fēng)險(xiǎn)從高原則，即不能區(qū)分重大軟件更新和輕微軟件更新則按照重大軟件 更新處理，不能區(qū)分增強(qiáng)類軟件更新和糾正類軟件更新則按照增強(qiáng)類軟件更新處理。

 

武漢華大智造提交的軟件描述文檔符合要求。