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摘要  目的: 建立聚乙二醇3350分子量與分布測定方法,并對3個廠家9批樣品進行比較研究。方法: 采用Waters凝膠滲透色譜（GPC）處理系統(tǒng)、示差折光檢測器進行分子量及分布測定,采用TA 差示掃描量熱儀（DSC） q2000系統(tǒng)對樣品的熱效應進行研究。結果: 該方法以分子量400~5 800范圍內的聚乙二醇對照品建立三階校正曲線,回歸系數(shù)0.999 9,各校正點平均偏差均小于2%,能夠準確測定聚乙二醇3350的重均分子量、分布系數(shù)等信息；DSC測定圖譜能夠反映樣品的純度,進一步確認相關質量。結論: 高效凝膠滲透色譜方法是測定聚乙二醇相關輔料分子量及分布的可靠方法,用于確定重均分子量、分布系數(shù)等多分散化合物關鍵質量參數(shù)具有操作簡單、結果準確的特點,配合差示掃描量熱法能夠分辨更多的質量屬性,可用于產(chǎn)品質量均一性監(jiān)控和輔料對比篩選研究。

 

關鍵詞: 分子量與分布；高效凝膠滲透色譜；差示掃描量熱法；聚乙二醇3350

 

Investigation of molecular weight distribution of pharmaceutical excipient polyethyleneglycol 3350

 

CHENG Jiye, JIN Weibin, GU Xiaofeng, ZHOU Zhenyu

(Suzhou Institute for Drug Control, Suzhou 215104,China)

 

Abstract Objective:  To establish a method for the determination of molecular weight distribution of polyethylene glycol 3350 and compare the differences of 9 batches of samples from 3 enterprises. Methods: The molecular weight and distribution of the samples were determined by Waters high performance gel permeation chromatography system(GPC) and differential refractive index detector. The thermal effects of the samples were confirmed by TA differential scanning calorimeter q2000 system(DSC). Results: The established method can accurately determine the weight-average molecular weight anddistribution coefficient of PEG 3350 by establishing a third-order calibration curve with PEG as a reference substance in the molecular weight range of 400-5800. The regression coefficient was 0.999 9, and the average deviation of each calibration point was less than 2%. The DSC spectrum can reflect the purity of the sample and further confirm the relevant quality. Conclusion: High performance GPC is a specific and accurate method for the determination of molecular weight and distribution of PEG-related excipients and can be applied to the determination of the weight-average molecular weight and distribution coefficient which is the key parameters of polydisperse compounds. In combination with differential scanning calorimetry,the method can identify more quality attributes, and be used for product quality uniformity control and excipients comparative screening study.

Key words: molecular weight anddistribution；highperformance gel permeation chromatography；differential scanning calorimetry；polyethylene glycol 3350

 

聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)是一類化合物的總稱,由環(huán)氧乙烷與水逐步縮合而成的聚合物,分子式為HO（CH2CH2O） nH,其中n代表氧乙烯基的平均數(shù),通過控制反應條件可以獲得一系列分子量（200~20 000）的產(chǎn)品。PEG水溶性好,低毒,生物相容性好,化學性質穩(wěn)定,作為增塑劑、潤滑劑、改性載體、穩(wěn)定劑等廣泛用于醫(yī)藥、日用化學等領域。PEG 3350的制劑臨床用于慢性便秘所致的腸易激綜合征的治療[1],在歐洲是臨床一線療法,也用于修飾抗體藥物和蛋白質藥物、制備前藥,可以提高穩(wěn)定性,優(yōu)化藥物在體內的藥動學特性[2]。不同分子量的聚乙二醇在吸水性、潤濕性等方面有較大差異,對臨床使用和制劑的釋藥性能具有重要影響[3-5],因此建立準確可靠的分子量與分子量分布測定方法十分必要。各國藥典（USP 43、EP 10.0）控制聚乙二醇分子量的方法均為端基分析法,通過酸堿滴定測定分子鏈末端氫氧根數(shù)量,折算平均分子量,該方法不能反映分子量分布信息,且操作過程繁瑣,實驗過程影響因素較多[6-7],結果對人員操作要求較高。高效凝膠滲透色譜利用體積排阻原理將分子量大小不同的物質有效分離,近年來在高聚物分子量分布研究中應用廣泛[8]。本文以此法為基礎,對影響測定結果的色譜條件及軟件處理參數(shù)進行了考察和優(yōu)化,對比了多家企業(yè)產(chǎn)品,同時對發(fā)現(xiàn)的差異通過差示掃描量熱法進行了熱效應曲線研究。本法結果準確、重現(xiàn)性好,可用于聚乙二醇相關產(chǎn)品的質量控制。

 

1  試驗部分

 

1.1  儀器與試劑

 

高效液相色譜儀（配有示差折光檢測器,Waters公司e2695-2414）；差示掃描量熱儀（TA公司q2000）,鋁坩堝（TA公司Tzero T180830）；電子分析天平（METTLER TOLEDO公司XS205DU）；超純水儀（MILLIPORE公司Milli-Q）；微孔濾膜（國藥集團化學試劑有限公司0.22 μm）。硝酸鈉（分析純,國藥集團化學試劑有限公司,批號:  20150508）；ProClinTM（SIGMA-ALDRICH,批號: MKCH7182）。

 

1.2 對照品與樣品

 

PEG對照品（分子量范圍430~5800,德國PSS公司,批號: pegkit-08）；PEG 3350（9批樣品來自于國內3家輔料企業(yè),遼寧A廠（批號180810387、180810388、180810389）,上海B廠（批號35187、35188、35189）,上海C廠（批號4453325、4447021、4480104）,編號分別為A1~A3；B1~B3；C1~C3）。

 

2  方法與結果

 

2.1  色譜條件

 

色譜柱: AgilentPL aquagel-OH 20（7.5mm×300 mm,8 μm,Agilent公司）；流動相: 0.1 mol·L-1硝酸鈉溶液（含0.02% ProClinTM）；流速: 0.5 mL·min-1；柱溫: 35 ℃；檢測器溫度: 35℃；進樣體積: 100 μL。對照品進樣類型為窄分布標準進樣,供試品進樣類型為寬分布樣品進樣。

 

2.2 熱分析條件

 

稱取待測物約3 mg置鋁坩堝中,分散均勻,壓蓋封裝,以空鋁坩堝為參比,進行測試。氣氛: 氮氣；流速50 mL·min-1；升溫程序: 起始25 ℃,迅速升溫至40 ℃,以2 ℃·min-1的速度升溫至80 ℃,記錄熱效應曲線。

 

2.3 溶液的制備

 

2.3.1  流動相

 

稱取硝酸鈉約8.5 g,加水適量溶解,加入ProClin 0.2 mL,用水稀釋至1 000 mL,混合均勻,用0.22 μm微孔濾膜濾過。

 

2.3.2  供試品溶液

 

取本品約0.1g,精密稱定,置于50 mL量瓶中,用流動相使完全溶解并稀釋至刻度,搖勻。

 

2.3.3  對照品溶液

 

取聚乙二醇系列對照品各約20 mg,精密稱定,分別至10 mL量瓶中,加流動相振搖,使完全溶解并稀釋至刻度,搖勻。

 

2.4 測定法

 

分別取對照品溶液和供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件,進樣,記錄色譜圖。分別輸入相應的標示分子量及分布系數(shù),以對照品保留時間（T）為橫坐標、以分子量對數(shù)(LogM)為縱坐標,建立三階校正曲線,將供試品主峰保留時間帶入校正曲線,計算重均分子量（Mw）及分布系數(shù)。

 

2.5 進樣精密度

 

與普通液相色譜不同,進樣量較小時（20 μL）PEG峰高較小,受基線影響積分重復性差,提高樣品濃度（1 mg·mL-1）,峰出現(xiàn)一定的展寬現(xiàn)象。經(jīng)過試驗,進樣量為100 μL、樣品濃度0.2·mg-1時,峰高適宜、進樣重復性好（供試品6次進樣保留時間的RSD%為0.21%）。

 

2.6 方法重復性

 

取一批供試品（A1）,按“2.3”項下方法平行制備6份溶液,依法測定,結果Mw分別為3 363、3 349、3 358、3 362、3 354、3 341,RSD% 0.25,與進樣精密度一致。多次取樣制備供試品溶液,測定的平均分子量結果一致,說明樣品的均勻性好。

 

2.7 供試品濃度

 

我們也考察了供試品濃度在小范圍（±20%）內變化時對結果的影響。取一批供試品（A1）,按“2.3.2”項下方法配制濃度為1.6、1.8、2、2.2、2.4 mg·mL-1的供試品溶液,分別進樣測試,Mw與RSD%結果與方法重復性基本一致。由于本實驗以主峰保留時間作為分子量計算的依據(jù),因此在適宜范圍內,供試品濃度變化對實驗結果無明顯影響。

 

2.8 線性與范圍

 

取PEG對照品430、1 030、2 100、3 450、5 800按 “2.4”項下方法測試,記錄色譜圖（見圖1）,建立三階校正曲線,得回歸方程: LogM=0.00665T 3-0.372T 2+6.59T–33.710,R 2=0.9999。

 

2.9 溶液穩(wěn)定性

 

取對照品（PEG 3450）溶液和供試品（A1）溶液,室溫放置,分別于0 、4 、8、12、24 h進樣分析,記錄色譜圖。結果對照品和供試品峰形無改變,峰高無減小,保留時間的RSD均小于0.52%,表明樣品在溶液中結構穩(wěn)定,同時流動相性質穩(wěn)定。

 

2.10 校正曲線檢查

 

由于本方法不是以色譜峰面積進行定量分析,不能以常規(guī)方法用對照品進行回收率試驗,故我們設計了校正曲線檢查,以驗證方法的準確性。稱取分子量2100、3450和5800的PEG對照品各3份,按“2.4”項下方法分別測定,用校正曲線計算各對照品的Mw,并與對照品證書標示值（Mw）比較,計算相對偏差%（見表1）。三個濃度水平的平均偏差分別為101.20%,99.05%,100.34%,均在分子量分布檢測誤差接受范圍內,表明方法準確度好。

 

圖1  聚乙二醇對照品校正曲線色譜圖（對照品Mw430、1030、2100、3450、5800）

Fig.1   The chromatograms of PEG standards forcalibration curve（StandardsMw430, 1030, 2100, 3450, 5800）

 

圖2  3個企業(yè)產(chǎn)品差示掃描量熱法熔融曲線（A1,B1,C1）

Fig.2   Melting curves of PEG 3350 from 3 enterprisesby differential scanning calorimetry（A1,B1,C1）

 

圖3  3個企業(yè)產(chǎn)品分子量分布檢測色譜圖（A1,B1,C1）

Fig.3  The chromatograms of molecular weight distribution of PEG 3350 from 3 enterprises（A1,B1,C1）

 

2.11  樣品測定

 

取3個企業(yè)共9批樣品（A1~A3；B1~B 3；C1~C3）照“2.3”項下方法,制備樣品溶液,進樣分析,結果（表2）表明,各批次產(chǎn)品的分布系數(shù)均較?。ǎ?.1）,說明產(chǎn)品分布寬度小；各企業(yè)的3批產(chǎn)品間分子量較接近（RSD%均＜2%）,說明各自生產(chǎn)工藝穩(wěn)定,但企業(yè)間結果差異明顯,A廠產(chǎn)品分子量大于B廠約10%,大于C廠約5%,雖然根據(jù)PEG 3350 的產(chǎn)品標準三家企業(yè)均符合規(guī)定,但其內在質量預期有一定的差異,將在后續(xù)討論中說明；另外,我們也依據(jù)藥典方法[6]對9批樣品的平均分子量進行了測定,結果（表2）與GPC法的結果基本一致。

 

表1  校正曲線的檢查

Tab.1  Accuracy of the calibration curve

 

注（Notes）: 1: 三階曲線（Third order curve）: LogM=0.00665T3-0.372T2+6.59T–33.710,R2=0.999 9; 2: 一階曲線（First order curve）: LogM=-0.313T+8.890,R2=0.998 1; 3: 二階曲線（Secondorder curve）: LogM=-0.001 07T2+0.073 4T+5.403, R2=0.9995; 4: 四階曲線（Forthorder curve）: LogM=0.004 29T4–0.303 5T3+8.02T2-94.1T +418.619,R2=1.000 0

 

表2  3個企業(yè)9批聚乙二醇3350的分子量測定結果

Tab.2  Determination results formolecular weight distribution of 9 batches PEG 3350 from 3 enterprises

 

3  討論

 

3.1  色譜條件的選擇

 

進行了高分子化合物分析,色譜柱是影響分離效果的最重要因素。我們對比了OHpak、TSKgel等幾款產(chǎn)品,Agilent PL aquagel-OH 20為粗內徑、大顆粒填料的體積排阻色譜柱,適合分析的化合物分子量范圍為100~20 000,經(jīng)過試驗,該柱獲得的色譜峰對稱、峰寬小、保留時間適宜,故選擇此柱為基礎進行后續(xù)試驗（見圖1）。流動相中0.1 mol·L-1硝酸鈉用于維持溶液的離子濃度穩(wěn)定,有利于獲得良好色譜峰形,ProClinTM是新型有機抑菌劑,低毒,環(huán)境友好,較低濃度可獲得抑菌效果,避免了以往凝膠色譜流動相中使用疊氮化鈉這類毒性強的抑菌劑對實驗人員和環(huán)境的危害。在該色譜柱推薦的流速范圍（0.5~1.0 mL·min-1）和柱溫范圍（20~65 ℃）內,我們考察了方法的耐用性。結果,不同條件對色譜峰保留時間及峰寬有影響,除極端情況（1.0 mL·min-1、65 ℃）導致不同分子量對照品出峰過快、擬合曲線分辨能力下降、樣品測定精密度差以外,常規(guī)流速（0.5~0.8 mL·min-1）和柱溫（20~40 ℃）對樣品測定結果并無明顯影響。

 

3.2 校正曲線的選擇

 

建立GPC分子量測定方法時,數(shù)據(jù)處理參數(shù)的確定需要不斷嘗試,在能夠獲得同品種對照品的情況下,以Waters empower軟件為例,首先確定“相關”模式進行數(shù)據(jù)處理,再優(yōu)化回歸曲線類型。本文比較了從一階到五階曲線對測定結果準確度的影響（見表1）,在選擇的2100、3450、5800三個分子量對照品校正點處,三階曲線擬合準確度最好（均小于2.0%）,一階和二階曲線準確度較低,五階曲線由于總校正點數(shù)的限制不能擬合,四階曲線的準確度雖然較小,但該擬合類型不適合分子量范圍小、校正點數(shù)少的情況。故最終選擇三階曲線用于樣品計算。

 

3.3 DSC方法參數(shù)的選擇

 

DSC是在程序控溫下,測定化合物熱流量隨溫度變化的技術,通過熱效應曲線的分析,可以研究物質的熔點、相轉變、聚合物組成等信息[9]。為了準確測定PEG的熱效應曲線,前期實驗對起始溫度、升溫速率、終止溫度、載樣量等參數(shù)進行優(yōu)化比較。結果（1）低于PEG 3350熔點（約為60 ℃）10 ℃以上,主峰峰形和峰值熔點沒有明顯影響,為反映低熔點組分的信息并盡可能縮短時間,確定起始溫度為40 ℃；（2）不同的升溫速率（1~10 ℃·min-1）直接決定了熱效應曲線的分辨能力,5 ℃·min-1以上時,由于升溫較快,PEG峰的變化細節(jié)被壓縮,低熔點峰不能觀察到,反之1 ℃·min-1時,所有峰加寬,分離有所提高,但時間過長,且得不到更多有效信息,故選定2 ℃·min-1；（3）PEG主峰之后,溫度約61℃,PEG3350 完全熔化,曲線平直,延續(xù)到100 ℃沒有其他熱效應,故設定80 ℃為終止溫度能夠顯示完整主峰；（4）樣品量設定在2~3 mg比較適宜,由于鋁坩堝裝載體積的限制,加入更多樣品導致熱傳導的延遲,使PEG吸熱峰變寬嚴重,曲線毛刺多,呈現(xiàn)過載的特征,不利于獲取有效信息。對B1樣品反復測試,顯示峰形、峰位重現(xiàn)良好,峰值熔點偏差在0.2℃以內,表明DSC方法重復性及B1樣品的均勻性較好。

 

3.4 產(chǎn)品質量分析

 

如前所述,3個企業(yè)各批次產(chǎn)品分子量均符合規(guī)定（±10%）,分布系數(shù)也十分接近,A企業(yè)分子量均值更接近標示值3350,質量上應該更好,但結合色譜圖（圖2）,發(fā)現(xiàn)B、C廠色譜峰更對稱平滑,A廠色譜峰有小的前沿峰,根據(jù)體積排阻色譜原理,分子量大的成分更早流出色譜柱,提示樣品中含有一定比例且分子量集中的高分子組分。不同分子量的PEG具有不同的熱力學參數(shù),可以通過DSC曲線直觀反映[10]。故我們進一步通過DSC考察了產(chǎn)品的熔融過程升溫曲線（方法見“2.2”項下）,圖2顯示A1和C1批樣品均測得低共熔峰（55.14℃、55.25℃）,且A1中比例更大,與主峰熔點（A1 59.67℃、C1 59.77℃）有差異明顯,表明存在低共熔組分,其熱性質與主成分有一定差異。而B1的熔融曲線呈單峰且熔程更窄,提示分子量組成更集中,離散的程度更小。B1峰值熔點為59.06℃比A1、C1更低,這與B1分子量三者中最小相吻合。為研究低共熔該現(xiàn)象,我們用分子量為2 000和6 000的PEG分別與PEG 3350按不同比例混合模擬A1、C1兩批樣品,但受制于實驗室小規(guī)模制樣技術,始終不能模擬出按既定工藝的大生產(chǎn)樣品,不能得到類似的熱分析曲線,沒能確定低共熔組分的分子量情況以及在樣品中的比例。這也說明熱分析是一種高靈敏的分析方法,可以反映樣品結構、組成方面細微的差異,對于多批樣品質量一致性的監(jiān)控有重要意義。

 

3.5 總結

 

高效凝膠滲透色譜是測定具有多分散性質的化合物分子量及其分布的有效方法,本文采用Agilent PL aquagel-OH 20（7.5 mm×300 mm,8 μm）色譜柱,建立了PEG 3350分子量分布測定方法,經(jīng)過對色譜條件和積分處理方法優(yōu)化和驗證,表明該方法適合分子量400~5800范圍內PEG的檢測,能夠獲得重均分子量、分布系數(shù)等多分散化合物重要信息,結合DSC方法,能夠發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)樣品間的更多質量差異,為生產(chǎn)企業(yè)多批產(chǎn)品質量均一性監(jiān)控和制劑企業(yè)輔料對比篩選提供依據(jù)。

 

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程繼業(yè), 金偉斌, 顧曉風, 周震宇（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心, 江蘇蘇州 215104）