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嘉峪檢測網 2022-01-17 23:04
摘 要：目的 制備他達拉非片并考察其體內外釋藥特性。方法 以溶出度為評指標，篩選他達拉非片各輔料用量及包衣增重。用相似因子（f2）法比較自制制劑與參比制劑在0.5%SDS溶液、含0.5%SDS的0.1mol/L的鹽酸溶液、含0.5%SDS的pH 4.5醋酸鈉緩沖液、含0.5% SDS的pH 6.8磷酸鹽緩沖液中溶出曲線的相似性。比較二者在Beagle犬體內的藥動學特征。結果 他達拉非片處方為他達拉非20mg、乳糖50M227.625mg、羥丙基纖維素 L10.5mg、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉19.6mg、SDS0.525mg、微晶纖維素M10270 mg、硬脂酸鎂1.75mg，包衣增質量范圍2%～4%。自制與參比制劑在4種溶出介質中的f2 均大于65，二者體外溶出行為相似。2種制劑在Beagle體內的藥學參數(shù)AUC0 ~ t 、Cmax 、tmax 均無顯著性差異，自制他達拉非片的相對生物利用度為（101.67±8.99）%。結論 成功制備他達拉非片，其體外溶和體內藥動學行為與參比制劑相似。
他達拉非是環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）特異性磷酸二酯酶 5 的可逆性抑制劑，通過增加陰莖海綿體內cGMP水平使平滑肌松弛，導致陰莖血流量增加而起到治療男性勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）的作用，與其他治療ED藥物相比，他達拉非具有選擇性高，半衰期長，耐受性好等優(yōu)點［1-3］。此外，他達拉非還可用于肺動脈高壓、良性前列腺增生等疾病的治療［4-5］。他達拉非由禮來公司研發(fā)，2003年11 月23日經美國 FDA 批準上市，商品名為希愛力 ® ，上市劑型為速釋片劑，規(guī)格為 20.0、10.0、5.0、2.5mg。
近年來，仿制藥質量和療效一致性評價工作不斷推進，本研究以國家藥品監(jiān)督管理局公布的參比制劑目錄為依據(jù)，選定由禮來公司生產的希愛力 ® 作為參比制劑仿制了規(guī)格為20 mg的他達拉非片，并以溶出度為評價指標，對他達拉非片的各輔料用量和包衣增質量進行優(yōu)化篩選［6-8］ ，同時考察了自制制劑和參比制劑體外溶出行為及二者在人體內的藥動學特征，比較二者的體內外釋藥特性。
一、材料
1.1 儀器
VG65/10 型混合制粒機、Combo 250 型流化床（德國Glatt公司）；Comil-U5型SLS可拓展多功能實驗系統(tǒng)（英國 Fitzpatrick 公司）；HBD-50 型混合機（南通貝特醫(yī)藥機械有限公司）；P3030 型壓片機（菲特壓片機械有限公司）；Perfima型包衣機（意大利 IMA 公司）；Distek 2500 型智能溶出儀（美國Distek 公司）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀、Finnigan TSQ Quantum Ultra型三重四極桿質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）和 Xcalibur3.0 工作站（美國Thermo公司）。
1.2 藥物及主要試劑
他達拉非原料藥（山東特琺曼藥業(yè)有限公司，批 號 20191002）；他 達 拉 非 對 照 品（自 制 ，批 號191201，質量分數(shù)99.48%）；他達拉非參比制劑（美國禮來制藥有限公司，批號C931765A，規(guī)格20mg）；乳糖200M（荷蘭DMV公司）；羥丙基纖維素L（日本曹達株式會社）；十二烷基硫酸鈉（SDS，德國巴斯夫股份公司）；微晶纖維素M102（明臺化工股份有限公司）；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（德國 J.RettenmaierSohne GmbH Co.KG）；硬脂酸鎂（荷蘭Peter GrevenNederland C.V.）；薄膜包衣預混劑（型號32K52002-CN，上?？房蛋录夹g有限公司）；水為純化水、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；地西泮標準品（中國食品藥品檢定研究院，批201211-231707，質量分數(shù)99.97%）。
1.3 動物
6只雄性Beagle犬，體質量8～12 kg，購于北京瑪斯生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2016-0001。實驗犬身體均健康，實驗前1周未服用任何藥物。
二、方法與結果
2.1 他達拉非片的制備
稱取他達拉非原料藥 20g、乳糖 50M 227.6g、羥丙基纖維素L 10.5g、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉9.8g，一起置于濕法制粒機中混合10min，另將 0.533gSDS溶于50.4g純化水中，加至上述混合物中濕法制粒，干燥后過 1 mm 篩網整粒，將微晶纖維素M10270g和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉9.8 g加入內顆粒中混合10 min，再加入硬脂酸鎂1.75g混合5min，壓片，包衣，即得。
2.2 溶出度測定方法的建立
2.2.1 色 譜 條 件 色 譜 柱 辛 基 硅 烷 鍵 合 硅膠（Agilent Zorbax SB-C8 ，5.0cm×4.6mm、3.5μm）；檢測波長225nm；流動相甲醇和水（50∶50）；柱溫40℃；體積流量1.0mL/min；進樣體積50µL。
2.2.2 溶液制備
對照品溶液：精密稱定他達拉非對照品25mg，至100 mL容量瓶中，用乙腈-水（1∶1）溶液超聲溶解并稀釋成0.25g/L 的貯備液，再取貯備液4mL，至50 mL量瓶中，用溶出介質稀釋成20 mg/L的對照品溶液。
供試品溶液：取自制和參比制劑各6片，按照溶出度測定漿法，以1000mL 0.5% SDS溶液為溶出介質，轉速為50r/min，分別于 5、10、15、20、30、45 min 取溶出液5.0mL（不補液），用0.45μm濾膜過濾，棄去3mL，取續(xù)濾液2mL作為供試品溶液。按照“2.2.1”項色譜條件測定，按外標法以峰面積計算累積溶出度，繪制溶出曲線。
2.2.3 方法學驗證
（1）專屬性考察：取溶出介質溶液、相應的空白輔料溶液、供試品溶液和對照品溶液，照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，結果顯示各溶出介質和輔料對主成分的測定均無干擾，對照品溶液和供試品溶液中主峰保留時間一致，表明該方法專屬性良好，代表性圖譜見圖1。
（2）線性關系考察：取對照品溶液適量，加溶出介質逐級稀釋為質量濃度分別為 0.5、2.5、5、10、20、30、40μg/mL的溶液，按照“2.2.1”項色譜條件測定，結果表明，他達拉非質量濃度在0.509 3～30.557 4 μg/mL與峰面積線性關系良好，回歸方程 Y＝7×10−6X－1.698×10−3 ，r＝0.999 98。
（3）濾膜吸附性考察：將溶出液分成2份，一份離心取上清液，另一份過濾2、4 mL后取續(xù)濾液，按照“2.2.1”項色譜條件測定，過濾2、4 mL所得續(xù)濾液的峰面積分別為離心所得上清液測得的峰面積的99.75%、100.01%，說明濾膜對他達拉非無吸附。
（4）重復性考察：溶出 45 min時于同一溶出杯中平行取6份供試品溶液，由不同人在不同儀器測定供試品的溶出度，結果顯示 6 份供試品溶液的RSD為0.59%。
（5）回收率考察：分 別 精 密 稱 取 約 1.6、2.0、2.4 mg的他達拉非原料藥置100 mL量瓶中，再加入處方中的其他輔料，用溶出介質稀釋至刻度，搖勻，作為80%、100%、120%濃度水平的供試品溶液，平行制備3份，進樣測定，3個濃度范圍內的平均回收率 分 別 為 99.68%、99.91%、99.77%，RSD 值 為0.12%，回收率符合規(guī)定。
（6）溶液穩(wěn)定性考察：溶出供試溶液和對照品溶液室溫放置，分別于0、4、8、12、24、48 h取樣，進樣分析，RSD 分別為 0.11%、0.60%，說明室溫放置48 h內穩(wěn)定性良好。
2.2.4 溶出曲線相似性評價 溶出曲線的相似性一般采用f2 相似因子法進行評價，計算公式如下。
n為取樣時間點個數(shù)，T i 和R i 分別為各取樣時間點自制制劑和參比制劑平均溶出度。
根據(jù)溶出曲線的相似性計算方法，他達拉非片自制品和參比制劑通常取3個點以上的溶出度結果進行計算，f2 ＞50時，表明兩條溶出曲線相似，f2 越大溶出曲線相似性越大。
2.3 單因素考察
他達拉非在藥劑學分類系統(tǒng)中為BCS II類，即低溶解性、高滲透性藥物［9］ ，影響此類藥物片劑質量的因素主要為稀釋劑、黏合劑、崩解劑等。本研究以溶出度為評價指標，采用單因素試驗對上述因素分別進行篩選。
2.3.1 乳糖50M與微晶纖維素比例的考察
乳糖50M和微晶纖維素M102均為稀釋劑，二者比例可以影響藥物溶出［8］ 。按照“2.1”項下方法，分別以乳糖50M和微晶纖維素M102質量比為5∶3、3∶1、7∶1制備片劑，考察其在0.5% SDS溶液中的溶出度，結果見圖2。
如圖2所示，隨著乳糖50M和微晶纖維素M102質量比增加，他達拉非片溶出速度隨之增加。計算3 種自制與參比制劑溶出曲線的 f 2 值分別為 57.1、93.5、49.2，且在壓片過程中發(fā)現(xiàn)乳糖50M和微晶纖維素M102質量比為5∶3時，細粉較多，物料流動性差，容易黏沖，綜合上述因素，確定乳糖50M和微晶纖維素M102質量比為3∶1。
2.3.2 黏合劑種類及用量的考察
為保證自制片劑與參比制劑的一致性，選擇羥丙基纖維素和羥丙甲纖維素為黏合劑。按照“2.1”項下方法，分別以羥丙基纖維素L用量3%、4%，羥丙甲纖維素E5LV用量3%、4%制備片劑，照“2.2”項下方法進行溶出度考察，結果見圖3。
在制粒過程中發(fā)現(xiàn)，羥丙基纖維素L和羥丙甲纖維素E5LV用量為4%時，所制得顆粒較硬，導致片劑崩解較慢；羥丙基纖維素 L 和羥丙甲纖維素E5LV用量為3%時，顆粒較均勻、流動性與可壓性均較好，所制得片劑性質在可接受標準之內。計算羥丙基纖維素L用量3%、4%和羥丙甲纖維素E5LV用量3%、4%時所制片劑與參比制劑溶出曲線的f 2值分別為80.3、40.0、62.9、43.2，綜合考慮，選擇羥丙基纖維素L為黏合劑，處方量為3%。
2.3.3 交 聯(lián) 羧 甲 基 纖 維 素 鈉 用 量 的 考 察
按照“2.1”項下方法制備片劑，考察交聯(lián)羧甲基纖維素鈉用量為 1.5%、2.8%、4.0% 時 ，對他達拉非片在0.5% SDS溶液中溶出的影響，結果見圖4。
由圖4中3種片劑溶出曲線可知，隨交聯(lián)羧甲基纖維素鈉用量的增加溶出速度加快，計算3者與參比制劑溶出曲線的f 2 值分別為55.8、82.9、58.4，觀察到交聯(lián)羧甲基纖維素鈉用量為2.8%時所制片劑與參比制劑的溶出最為相似。經考察，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉的加入方式采用內外加時，能保證片劑溶出速率的均衡，故確定交聯(lián)羧甲基纖維素鈉用量為2.8%，其中 1.4% 加入內顆粒中，另 1.4% 加入外顆粒中。
2.3.4 SDS 用量的考察
他達拉非原料藥幾乎不溶于水，因此需要加入增溶劑以保證其溶解，選用SDS為增溶劑，按照“2.1”項下方法，分別以SDS用量 0.10%、0.15%、0.20% 制備片劑，考察其在 0.5%SDS溶液中的溶出行為，結果見圖5。
如圖5所示，SDS用量與45 min時片劑累計溶出率呈正相關，但 SDS用量為 0.20% 時 5 min溶出度較低，原因為SDS用量過大會降低溶出介質的表面張力，不利于片劑崩解。計算自制片劑與參比制劑溶出曲線的 f 2 值分別為 50.7、88.2、59.4。選擇SDS用量為0.15%。
2.3.5 硬脂酸鎂用量的考察
按照“2.1”項下方法，分別以硬脂酸鎂用量 0.25%、0.50%、0.75% 制備片劑 ，按照“2.2”項下方法進行溶出度考察 ，結果見圖6。
如圖6所示，硬脂酸鎂用量對他達拉非片的溶出無影響。硬脂酸鎂用量為 0.25%、0.50%、0.75%時，f 2 值依次為74.3、86.3、60.6。但在壓片過程中發(fā)現(xiàn)硬脂酸鎂用量為0.25%時，存在黏沖現(xiàn)象，不利于操作。從處方耐用性考慮，最終選擇硬脂酸鎂用量為0.5%。
2.3.6 包衣增質量的考察
包衣增質量對藥物的溶出也有影響，按照“2.1”項下方法制備片劑，包衣增質量分別為2%、3%、4%，考察包衣增質量對藥物在0.5% SDS溶液中溶出的影響，結果見圖7。
如圖7所示，包衣增質量為2%、3%、4%時對他達拉非片的溶出行為無明顯影響，計算f 2 值依次為61.4、90.9、87.5，因 此 將 包 衣 增 質 量 設 定 在2%～4%。
2.4 處方工藝的驗證
2.4.1 含量與有關物質檢測方法
根據(jù)美國藥典各論中收載的他達拉非片檢測方法進行含量和有關物質的檢測，具體操作如下：
（1）色 譜 條 件 ：色 譜 柱 辛 基 硅 烷 鍵 合 硅膠（Agilent Zorbax SB-C8 ，15.0cm×4.6mm，3.5μm）；檢測波長285nm；乙腈、水和三氟乙酸（35∶65∶0.1）為流動相；柱溫35 ℃；體積流量1.0 mL/min；進樣體積10 µL。
（2）樣品溶液制備：取25片片劑，置500mL量瓶中，加約400mL稀釋液［乙腈和水（1∶1）］，機械振搖15min，使片劑分散，用稀釋液定容，搖勻，靜置至少1h后，精密量取上述溶液2.5mL，置10 mL量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，過0.45µm濾膜，棄去3mL，取續(xù)濾液檢測。
2.4.2 含量均勻度
稱取1片片劑，置200mL量瓶中，加入體積約100mL稀釋液［乙腈和水（1∶1）］，機械振搖15min，用稀釋液定容至刻度 ，搖勻 ，過0.45 µm 濾膜，棄去3mL，取續(xù)濾液，采用紫外分光光 度 法 ，在 285 nm 波 長 處 測 定 樣 品 溶 液 吸 光度（A）值。
2.4.3 優(yōu)化處方的確定
中試批（批量60000片）：將他達拉非原料藥1.200kg、乳糖50M13.657kg、羥丙基纖維素L0.630kg、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉0.588 kg一起過20目篩后，置于濕法制粒機中混合10min；另將 0.032kg SDS溶于3.024 kg純化水中，加至上述混合物中制軟材，過5mm篩網制粒，于40 ℃流化床干燥至顆粒水分≤2%，過1mm篩網整粒；將微晶纖維素M102 4.200 kg 和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉0.588kg加入內顆粒中混合10min （轉速10r/min），加入過60目篩的硬脂酸鎂0.105g，總混5min （轉速10r/min），壓片，沖模尺寸12.7 mm×7.5mm，控制片質量339.5～360.5mg，片劑硬度80～100N，包衣，得3批中試片劑（批號 200701、200702、200703）。取中試3批的他達拉非片，依法檢測質量分數(shù)、含量均勻度、溶出度、有關物質，結果見表1。
如表1所示，中試3批他達拉非片的質量分數(shù)、含量均勻度、有關物質結果均符合《中國藥典》2020年版的要求 ；按照“2.2”項下方法測定溶出度 ，在 10 和 30 min 累計溶出率的RSD分別為4.64%、1.00%，表明自制片劑的溶出均一性好；按照“2.2”項下方法測定溶出曲線，累計溶出率的RSD值均小于10%，結果表明自制片劑工藝穩(wěn)定、中試批的批間重現(xiàn)性良好。
2.4.4 體外溶出行為的比較
取自制他達拉非片，分別測定其在 0.5% SDS 溶液（A）、含 0.5% SDS的 0.1 mol/L 的鹽酸溶液（B）、含0.5% SDS的pH 4.5醋酸鈉緩沖液（C）、含0.5% SDS的pH 6.8磷酸鹽緩沖液（D）4種溶出介質中的溶出度，繪制溶出曲線，見圖8。并與他達拉非參比制劑的溶出曲線進行比較，溶出曲線的f 2 值見表2。
按溶出行為相似因子f 2 法進行判斷，只要f 2 值大于50即可認定為溶出行為相似［10］ ，由表2可知，自制制劑與參比制劑4種溶出介質中溶出曲線的f 2 值均大于65，由此判斷，2者在4種溶出介質中的體外溶出行為相似。
2.5 體內藥動學研究
2.5.1 給藥方法與血樣采集
采用單劑量雙周期交叉試驗方案，將6只雄性Beagle犬隨機分為A、B兩組，每組3只，試驗前禁食至少12h，采完空白血液后，可飽腹給藥。A 組 Beagle 犬 ig 參比制劑 1片（規(guī)格20 mg），B組Beagle犬ig自制制劑1片（規(guī)格 20mg），采集樣品結束后 ，經1周洗脫期 ，給Beagle犬交叉服藥。
分別在給藥后0.33、0.67、1.00、1.50、2.00、2.50、4.00、8.00、12.00、24.00、36.00、48.00、64.00 h 于Beagle犬的前肢或后肢靜脈取血4 mL，置1%肝素抗凝的離心管中，在3000r/min離心10min后，取上清液置于−20 ℃冰箱中保存待測。
2.5.2 血漿樣品測定［11］
色譜條件：色譜柱 Shim-pack Scepter C 18 -120（100mm×2.1mm，3mm）；流動相10 mmol/L乙酸銨溶液–甲醇（10∶90）；體積流量0.3mL/min；柱溫40 ℃。
質譜條件：電噴霧電離源；正離子模式；多重反應監(jiān)測；毛細管溫度350 ℃；鞘氣5.25 MPa；輔助氣1.75 MPa；他達拉非和內標地西泮的碰撞電壓為40、35 V、碰撞能為22、30 eV；用于定量分析的離子反 應 分 別 為 m/z389.5→258.2（他 達 拉 非）、m/z284.3→151.4 （地西泮）。
血漿樣品的處理：取各時間點血漿樣品300μL，加入質量濃度為200 ng/mL的地西泮內標溶液（甲醇溶解、稀釋）30μL，渦旋混勻后，加入醋酸乙酯4mL，再渦旋3min。3000r/min離心10min，取上清液3.0mL，用氮氣在室溫下吹干，用100μL流動相復溶，渦旋3min，6000r/min離心10min，取上清液進樣測定。
2.5.3 檢測結果
Beagle犬ig給予參比制劑和自制制劑后，平均血藥濃度-時間曲線見圖9。
不同時間點血藥濃度經DAS 2.0藥動學軟件的非房室模型擬合，主要藥動學參數(shù)見表3。
對自制制劑和參比制劑藥動學參數(shù)進行配對t檢驗分析，結果無統(tǒng)計學差異，表明2個制劑在人體內釋藥特征無明顯差異。與參比制劑相比，自制片劑的口服相對生物利用度為（101.67±8.99）%。
三、討論
生物藥劑學分類系統(tǒng)中，在37 ℃、pH值1.0～7.5內，單次最大給藥劑量的藥物可溶于不多于250mL的介質時，則認為該藥物是高溶解性的，反之為低溶解性［9］。他達拉非單次最大給藥劑量為20mg，經溶解度預試驗，20mg 他達拉非原料藥在純化水、0.1mol/L的鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鈉緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液中完全溶解所需體積依次為 5882、6250、6666、7407mL，均大于250mL，由此可判斷他達拉非為難溶性藥物。
以參比制劑的溶出行為，考察溶出度曲線的區(qū)分力。他達拉非參比制劑在 0.5%SDS 溶液、含0.5%SDS 的0.1mol/L 的鹽酸溶液、含 0.5%SDS 的pH 4.5醋酸鈉緩沖液、含0.5%SDS的pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，10min 溶出度達 40%，30min 溶出度達80%，因此，用其作為溶出介質考察自制制劑與參比制劑的體外釋藥特性。
體內實驗采用單劑量雙周期交叉試驗方案，分別考察了自制制劑與參比制劑在Beagle犬體內的藥動學參數(shù)。采用 LC-MS/MS法測定他達拉非的血漿濃度，該法重現(xiàn)性好、專屬性強，可滿足他達拉非血漿濃度的測定要求。對自制制劑和參比制劑體內藥動學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析，結果無顯著性差異，說明二者在體內的藥動學過程相似。
本研究成功仿制了他達拉非片，其處方工藝可實現(xiàn)中試批次生產，重現(xiàn)性良好，產品質量均符合質量標準。體內外評價表明，自制制劑與參比制劑的體外溶出行為相似，體內藥動學參數(shù)無顯著性差異，符合仿制藥質量和療效一致性評價的要求，為他達拉非片的研發(fā)和生產提供了有力的科學依據(jù)。
來源：Internet
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