中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

摘要　目的：采集無菌制劑生產(chǎn)車間潔凈區(qū)環(huán)境微生物，應(yīng)用全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，并進(jìn)行耐藥分析。方法：采樣方法有沉降菌法、定量空氣浮游菌采樣法和表面取樣法，對(duì)采集到的沉降菌、浮游菌、人員及設(shè)備表面微生物按照菌種鑒定儀使用說明書操作進(jìn)行菌種鑒定和耐藥性檢測(cè)。結(jié)果：從 345個(gè)樣本中，檢出微生物115株，其中沉降菌105株，浮游菌6株，人員及表面微生物4株；115株菌鑒定為46個(gè)菌種，分屬于20個(gè)菌屬?？尚畔蘧?95% 以上。其中還檢出了3株耐藥菌。結(jié)論：對(duì)無菌GMP車間環(huán)境微生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并建立藥品GMP生產(chǎn)企業(yè)微生物信息庫，可以更好地指導(dǎo)藥品GMP 企業(yè)實(shí)現(xiàn)有效的微生物管理。

 

隨著《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2010年修訂）（以下簡(jiǎn)稱“GMP”）和《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）的相繼推行實(shí)施，藥品生產(chǎn)的質(zhì)量管理水平已被提升到了新的高度，藥品GMP車間微生物監(jiān)控也備受重視和關(guān)注［1］。近年來，“欣弗事件”、“刺五加事件”等微生物污染藥品的事件仍有發(fā)生，對(duì)公眾用藥安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅［2-3］。因此，對(duì)藥品生產(chǎn)、檢測(cè)環(huán)境及過程中微生物種類及分布的研究，建立藥品生產(chǎn)及檢測(cè)環(huán)境中微生物信息庫，將有助于藥品GMP企業(yè)采取合適的消毒滅菌、過程分析措施控制藥品，特別是無菌藥品生產(chǎn)中的微生物污染，提高藥品質(zhì)量，為可能發(fā)生的、上市后藥品微生物污染藥害事件的溯源分析、無菌檢查“一次性檢驗(yàn)”及應(yīng)急處理提供技術(shù)依據(jù)。對(duì)保障公眾用藥安全、有效，有著重大意義。

 

本試驗(yàn)從藥品注射劑生產(chǎn)企業(yè)GMP車間及其周圍環(huán)境易受微生物污染的各個(gè)關(guān)鍵部位采集樣本，結(jié)合微生物生化鑒定等方法，建立藥品GMP生產(chǎn)企業(yè)微生物信息庫，指導(dǎo)藥品GMP企業(yè)實(shí)現(xiàn)有效的微生物管理。

 

一、材料與方法

 

1.1 材料

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基均購自北京奧愽星生物有限公司。

VITEK2Compact自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）；Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（美國(guó)海凈納（原美國(guó)杜邦）公司）

 

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)控菌株鑒定　

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌和大腸埃希菌的 1 代培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，于30~35 ℃培養(yǎng)18h，刮取菌苔用 Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和VITEK2Compact 自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定，參數(shù)設(shè)置培養(yǎng)溫度為36 ℃，菌液濁度為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋∕CF）。

1.2.2 樣品的采集　

根據(jù)GMP車間、周圍環(huán)境的房間數(shù)量和面積，對(duì)所有可能影響到產(chǎn)品質(zhì)量和易受微生物污染的關(guān)鍵部位進(jìn)行微生物樣本采集。同時(shí)采集生產(chǎn)人員、設(shè)備等生產(chǎn)環(huán)節(jié)的微生物樣本。

主要采集2016—2018年的人員及設(shè)備表面微生物、沉降菌、浮游菌共345株，每個(gè)季度采集1次。①人員：采用壓指試驗(yàn)、表面接觸（頭、胸、手腕、肘、膝蓋）平皿；②設(shè)備：表面擦拭；③環(huán)境：沉降菌（A級(jí)、B 級(jí)、C 級(jí)、D 級(jí)）、浮游菌（A 級(jí)、B 級(jí)）［4-7］。將所有的平皿置于30~35 ℃培養(yǎng)不少于3d。

 

1.3 環(huán)境微生物菌型檢測(cè)

將所培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行劃線分離，得到的單菌落轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)肉湯置-80℃冷凍保存。同時(shí)進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并進(jìn)行革蘭染色，根據(jù)染色結(jié)果選擇后繼菌種鑒定需要的是陽性還是陰性鑒定卡。然后按照VITEK2Compact 自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)或Phoenix-100 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀說明書中的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行測(cè)定，一般2~10h給出鑒定結(jié)果。其中在Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀上同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌藥敏性試驗(yàn)。

菌種鑒定實(shí)驗(yàn)過程：（1）將分離純化的新鮮菌苔用無菌棉拭子加入到相應(yīng)的菌種鑒定用培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛鹊?.5，并混勻。（2）將菌液從菌種鑒定卡上端的加樣口緩慢加入。（3）掃描菌種鑒定卡后面的條碼，儀器自動(dòng)識(shí)別后裝入儀器，開始運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，讀取報(bào)告。

藥敏試驗(yàn)過程：（1）使用之前，把藥敏指示劑溶液添加到藥敏培養(yǎng)液試管中并保存在黑暗中達(dá)8h。只用1滴從滴瓶自由落下的藥敏指示劑溶液。（2）將分離純化的新鮮菌苔用無菌棉拭子加入到相應(yīng)的菌種鑒定用培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛鹊?.5，并混勻。（3）用移液槍吸取25μL 上述菌液加入到藥敏培養(yǎng)液試管中。（4）將菌液從菌種鑒定及藥敏鑒定卡上端的加樣口緩慢加入。（5）掃描菌種鑒定卡后面的條碼，儀器自動(dòng)識(shí)別后裝入儀器，開始運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，讀取報(bào)告。

 

二、結(jié)果

 

2.1 質(zhì)控菌株檢測(cè)結(jié)果

用 VITEK2Compact 自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)或Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀生物檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)上述已知的金黃色葡萄球菌等共4株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株完全相符，可信度在98% 以上，見表1。

 

 

2.2 環(huán)境微生物鑒定結(jié)果

通過對(duì)所收集的環(huán)境菌共樣本345個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行整理和分析。檢出的微生物115株（其中人員及設(shè)備表面微生物4株，浮游菌6株，沉降菌105株）為46種菌種，分別來自20個(gè)菌屬。排在前3位的是葡萄球菌屬共48株，庫克菌屬共16株，鞘氨醇單胞菌屬共13株，其余的菌屬包括埃希氏桿菌屬、棒狀桿菌屬、巴斯德氏菌、伯克氏菌屬、腸球菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、顆粒鏈菌屬、克雷伯菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、氣單孢菌屬、沙雷氏菌屬、威克斯菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬、耶爾森氏菌屬。根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果分類，革蘭氏陽性總共92株，占總數(shù)80%；革蘭氏陰性總共23株，占總數(shù)的20%。詳細(xì)結(jié)果見表2。

 

結(jié)果表明：（1）浮游菌、人員及表面微生物共10株，以葡萄球菌革蘭氏陽性球菌為主占60%，其次為居泉沙雷菌及成團(tuán)泛菌等革蘭氏陰性桿菌占30%。（2）沉降菌共105株，葡萄球菌屬、庫克菌屬、鏈球菌屬等革蘭氏陽性球菌占71%；其次為鞘氨醇單胞菌、氣單孢菌屬、假單胞菌屬等革蘭氏陰性桿菌占22%；革蘭氏陽性桿菌占1%；革蘭氏陽性芽孢桿菌占6%。詳細(xì)見圖1和圖2。其中檢出3株葡萄球菌具有耐藥性。檢出的其中1株耐藥菌的耐藥特征見圖3。

 

 

 

 

2.3 潔凈區(qū)微生物污染分析

2.3.1 Ａ級(jí)區(qū)污染微生物結(jié)果分析　

該企業(yè)Ａ級(jí)區(qū)環(huán)境菌監(jiān)控結(jié)果，共收集到4株微生物，占污染微生物總數(shù)的 3.5%。3株為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌，1株為庫克菌。在Ａ級(jí)區(qū)的微生物污染物數(shù)量、類型相對(duì)較少。說明A級(jí)區(qū)的微生物隔離系統(tǒng)起到了很好的隔離作用。也有可能是因?yàn)椴僮魅藛T較少的緣故。

2.3.2 Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)污染微生物結(jié)果分析　

Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)共收集到111株微生物，占污染物總數(shù)的96.5%。環(huán)境微生物監(jiān)控分離微生物仍以葡萄球菌屬為主，合計(jì)48株（占Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)總分離株的43.2%）。其中，沃氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌和金黃色葡萄球菌分別占Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)總分離株的8.1%、6.3% 和5.4%，且多分布在更衣室和潔凈走廊、消毒室，可見微生物污染與人員活動(dòng)密切相關(guān)。

2.3.3 表面污染微生物結(jié)果分析　

采集到操作人員和設(shè)備表面微生物共4株均來自Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)，占全部污染菌總數(shù)的3.5%。2株為葡萄球菌，1株為棒狀桿菌，1株為氣單胞菌。

 

三、討論

 

3.1 微生物污染源分析

從菌型分析結(jié)果可知，該無菌制劑生產(chǎn)企業(yè)潔凈區(qū)人員及設(shè)備表面微生物及沉降菌樣品檢出率最高的是革蘭陽性菌，而居其首位的是葡萄菌屬，此類菌廣泛存在自然界中，是人體的皮膚及呼吸道黏膜表面的正常菌群，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)可引起

各種疾?。?］。其次為庫克菌屬，此類菌主要分布在水、土壤等自然環(huán)境中以及哺乳動(dòng)物、人的皮膚、黏膜和口咽部。以往認(rèn)為克氏庫克菌是很少見的條件致病菌，未引起足夠的重視。近年來由該菌引發(fā)的感染增加較快，特別是血流感染和皮膚軟組織感染［9-10］。另外，最近楊銳等［11］從醫(yī)務(wù)人員手、皮膚黏膜、物體表面、空氣等醫(yī)療環(huán)境樣本中已檢出８株克氏庫克菌。第3位為鞘氨醇單胞菌，是一種能夠合成生物聚合物的重要微生物菌種資源。潔凈區(qū)檢出均為人員帶入，進(jìn)入凈化區(qū)，樹立無菌觀念，從根本上降低污染的發(fā)生。從各區(qū)域微生物分離數(shù)量看，A級(jí)區(qū)的微生物污染數(shù)量明顯比 B級(jí)和C級(jí)區(qū)的微生物污染數(shù)量小很多，符合區(qū)域隔離和空氣凈化的規(guī)律［12-13］。

 

3.2 制藥企業(yè)微生物污染監(jiān)測(cè)作用

3.2.1 評(píng)價(jià)無菌車間滅菌程序的有效性　

無菌制劑車間環(huán)境微生物污染檢測(cè)可以評(píng)價(jià)無菌車間滅菌程序的有效性，可以根據(jù)微生物種類選擇適宜的消毒劑。該制藥企業(yè)分離的微生物采集到的微生物 91%以上為沉降菌。除了加強(qiáng)消毒驗(yàn)證，還要注意高效過濾系統(tǒng)的清洗和更換頻率是否滿足要求。

3.2.2 建立警戒線和糾偏限　

通過對(duì)數(shù)據(jù)的分析建立警戒線和糾偏限，當(dāng)出現(xiàn)某種微生物或微生物指標(biāo)超限時(shí)就應(yīng)啟動(dòng)滅菌程序。系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)比如微生物指標(biāo)超出正常范圍但未達(dá)到糾偏限度，需要引起警覺，可能需要采取糾正措施的限度標(biāo)準(zhǔn)為糾偏限度；系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)比如微生物指標(biāo)超出可接受標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行調(diào)查并采取糾正措施的限度標(biāo)準(zhǔn)。制訂警戒限度和糾偏限度方式：（1）（臨界值法）對(duì)一個(gè)時(shí)期內(nèi)所有數(shù)據(jù)以柱狀圖模式給出，原則取最近100個(gè)采樣數(shù)據(jù)，以第95區(qū)間和第 99 區(qū)間作為警戒限度和糾偏限度；（2）（正態(tài)分布法）警戒限度 = 平均值 +2σ；糾偏限度 = 平均值+3σ［14］。

3.2.3 對(duì)污染菌進(jìn)行溯源分析　

當(dāng)監(jiān)測(cè)結(jié)果超出糾偏限度時(shí)，則必須立刻啟動(dòng)偏差管理系統(tǒng)或管理系統(tǒng)，對(duì)系統(tǒng)超標(biāo)的原因進(jìn)行調(diào)查，環(huán)境檢測(cè)建立的數(shù)據(jù)庫可以進(jìn)行溯源分析，幫助判斷是哪一環(huán)節(jié)出現(xiàn)了問題［15］。

根據(jù)2010年版GMP要求，若無菌產(chǎn)品檢查結(jié)果出現(xiàn)陽性時(shí)，應(yīng)進(jìn)行原因調(diào)查。隨著藥品檢驗(yàn)技術(shù)和理念的不斷更新，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版微生物檢查法愈加關(guān)注生產(chǎn)過程中的微生物控制，強(qiáng)調(diào)通過“實(shí)驗(yàn)室調(diào)查回顧、利用適宜方法”分析檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。調(diào)查回顧涉及到藥品生產(chǎn)檢驗(yàn)的人、機(jī)、料、法、環(huán)5個(gè)方面。而我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)GMP車間人員，設(shè)備和空氣系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，建立了該企業(yè)凈化區(qū)的微生物數(shù)據(jù)庫，當(dāng)樣品中檢出陽性時(shí)，可以對(duì)檢出菌與數(shù)據(jù)庫中菌進(jìn)行鑒別比對(duì)，同源性分析，找到可能的污染源，幫助企業(yè)采取高效有針對(duì)性的糾偏措施［16］。

3.2.4 對(duì)污染菌進(jìn)行耐藥分析　

在檢出的細(xì)菌中有3株耐藥菌，均為葡萄球菌屬；1株為腐生葡萄球菌，能產(chǎn)青霉素酶，對(duì)吉他霉素、青霉素 G、紅霉素、和莫匹羅星產(chǎn)生耐藥；1株為表皮葡萄球菌，能產(chǎn)青霉素酶，對(duì)苯唑西林、青霉素G耐藥；1 株為沃氏葡萄球菌能產(chǎn)青霉素酶，對(duì)妥布霉素、青霉素G和紅霉素耐藥。

β- 內(nèi)酰胺類抗生素共同具有1個(gè)核心 β- 內(nèi)酰胺環(huán)，其基本作用機(jī)制是與細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成；β- 內(nèi)酰胺酶借助其分子中的絲氨酸活性位點(diǎn)，與β- 內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)合并打開β- 內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致青霉素類藥物失活，產(chǎn)生耐藥性［17］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)境中人葡萄球菌和表皮葡萄球菌對(duì)頭孢類、氨基苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類藥物敏感；人葡萄球菌和溶血葡萄球菌對(duì)四環(huán)素類藥物敏感；葡萄球菌對(duì)磺胺類藥物有不同程度的耐藥［18-20］。

喹諾酮類藥物主要作用于細(xì)菌的DNA回旋酶和Ⅳ類拓?fù)洚悩?gòu)酶阻礙DNA復(fù)制，當(dāng)該2種酶的結(jié)構(gòu)變異即可導(dǎo)致耐藥，對(duì)喹諾酮類耐藥主要表現(xiàn)在gyrA 基因的變異而影響此類藥物與靶位的結(jié)合，從而影響細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，產(chǎn)生耐藥［21-22］。

試驗(yàn)中的菌株均采集自生產(chǎn)抗生素藥品的GMP凈化車間，說明環(huán)境中的細(xì)菌長(zhǎng)期與低劑量的藥物殘留共存，可能是導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性的原因之一，要加強(qiáng)車間清洗驗(yàn)證和監(jiān)控。