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歐洲藥典委員會(huì)在第152次會(huì)議上（2015.06）批準(zhǔn)了新版技術(shù)專論的技術(shù)指南（第7版）的發(fā)行，在EDQM網(wǎng)站可查。在本文件中，在響應(yīng)和校正因子部分進(jìn)行了完善，提供了關(guān)于如何確定這些因子的詳細(xì)說明。

 

第7版技術(shù)指南中相關(guān)章節(jié)是以下文章的摘錄，其中提供了關(guān)于響應(yīng)和校正因子定義以及測定二者的詳細(xì)信息，并展示了分析人員可能面臨的挑戰(zhàn)以及如何克服這些挑戰(zhàn)的示例。

 

 

介紹

 

歐洲藥典的大多數(shù)專論都采用液相色譜法紫外檢測器進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的測定[1]。這些試驗(yàn)用于測定產(chǎn)物或合成副產(chǎn)物或降解物等雜質(zhì)。

 

最近的專論區(qū)分了特定雜質(zhì)和非特定雜質(zhì)[2]，特定雜質(zhì)存在單獨(dú)的接受標(biāo)準(zhǔn)，因此有必要在色譜系統(tǒng)中準(zhǔn)確的鑒定它們。這里的鑒定，不要和闡明結(jié)構(gòu)的鑒別，意義弄混淆，更好的表述應(yīng)該是“峰鑒別”。后者最好使用化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CRS）進(jìn)行，由于不能獲得足夠量的單個(gè)雜質(zhì)，亦可使用該專論物質(zhì)（即待測物，以下稱為供試品）和特定雜質(zhì)的混合物或者是沒有加入供試品的雜質(zhì)混合物進(jìn)行[3]。

 

專論中不僅提供了在色譜系統(tǒng)中鑒別這些雜質(zhì)的方法，同時(shí)描述了如何對(duì)其定量。

 

定量

 

樣品中雜質(zhì)的量通常使用“外標(biāo)法”測定，但也采用面積歸一化法。

 

當(dāng)使用外標(biāo)法時(shí)，優(yōu)先的選擇是使用單個(gè)雜質(zhì)來制備含有這些雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度應(yīng)在特定雜質(zhì)的限度范圍內(nèi)，即相對(duì)于供試液的濃度0.1~1.0%之間。

 

然而，如上所述，這些雜質(zhì)通常不能獲得足夠量作為單獨(dú)的對(duì)照品并建立標(biāo)準(zhǔn)。這種情況下，可以將供試液的稀釋液，例如1/100供試液，作為測定樣品中這些雜質(zhì)量的對(duì)照。當(dāng)供試品與雜質(zhì)具有相似的吸收曲線時(shí)，即在選定的波長下檢測器的響應(yīng)是相似的，可以選擇此法。另一方面，不同的吸收曲線可能會(huì)導(dǎo)致在所選波長處響應(yīng)值有明顯的不同。因此，在方法學(xué)驗(yàn)證中，測定特定雜質(zhì)的響應(yīng)因子的必要的。同時(shí)，優(yōu)化選擇合適的檢測波長是有用的。

 

響應(yīng)和校正因子的定義

 

如文獻(xiàn)[4]中論及，“響應(yīng)因子”和“校正因子”表達(dá)的含義通常以不同的方式處理。根據(jù)歐洲藥典[5]，響應(yīng)因子（或相對(duì)響應(yīng)因子relative response factor，RRF）表示指定物質(zhì)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測器靈敏度，即相同濃度下雜質(zhì)的檢測器響應(yīng)與供試品的檢測器響應(yīng)的比例。專論中給出的校正因子是響應(yīng)因子的倒數(shù)，供試液采集得到的色譜圖中雜質(zhì)峰面積必須乘以該校正因子。通常，響應(yīng)因子使用以下表達(dá)式來計(jì)算：

 

RRF=（Ai/As）×（Cs/Ci）

RRF：響應(yīng)因子；

Ai:雜質(zhì)峰面積；

As:供試品的峰面積；

Cs：供試品的濃度，mg/ml；

Ci：雜質(zhì)的濃度，mg/ml

 

為了進(jìn)行計(jì)算，可以使用整個(gè)線性范圍內(nèi)的峰面積比的平均值，或者使用雜質(zhì)和供試品的線性回歸方程的斜率比值。

 

在歐洲藥典的技術(shù)指南中還討論了響應(yīng)和校正因子的含義及正確的使用方法[6]。根據(jù)通則2.2.46色譜分離技術(shù)與指南，當(dāng)雜質(zhì)與供試品的響應(yīng)值之比落在0.8~1.2范圍之外，必須對(duì)雜質(zhì)峰面積進(jìn)行校正，即在0.8~1.2范圍內(nèi)不考慮響應(yīng)值的差異。因此，在所有情況下，對(duì)于特定雜質(zhì)，在專論的驗(yàn)證過程中檢測到超出該范圍的響應(yīng)因子，即校正因子也在該范圍之外，則在專論的有關(guān)物質(zhì)部分中說明相應(yīng)的校正因子。

 

然而，沒有提供關(guān)于如何確定響應(yīng)和校正因子的指南。

 

響應(yīng)因子的確定

 

響應(yīng)因子可以通過制備一定濃度的雜質(zhì)溶液和供試品溶液，在指定波長和流速下對(duì)這些溶液進(jìn)行色譜分析，然后使用上述公式對(duì)峰面積進(jìn)行比較來確定。理想情況下，雜質(zhì)的濃度和供試品的濃度應(yīng)在同一數(shù)量級(jí)上，并且應(yīng)在雜質(zhì)的接受標(biāo)準(zhǔn)濃度附近，測定的多點(diǎn)校正曲線進(jìn)行計(jì)算。

 

然而，不僅要稱量相應(yīng)量的雜質(zhì)和供試品比較峰面積，非常重要的是，還要針對(duì)所測試物質(zhì)的純度進(jìn)行校正。理想情況下，應(yīng)測定雜質(zhì)和供試品的色譜純度、水分和殘留溶劑的量。含量將根據(jù)以下公式計(jì)算，該公式將遵循對(duì)照品賦值時(shí)相同的程序[3]：

 

含量（%）=[100-(水分+殘留溶劑)]×色譜純度百分比/100

上述提到的公式中Cs和Ci將根據(jù)雜質(zhì)和供試品的含量進(jìn)行校正：

RRF=（Ai/As）×（Cs×Ps/Ci×Pi）

RRF：響應(yīng)因子；

Ai:雜質(zhì)峰面積；

As:供試品的峰面積；

Cs：供試品的濃度，mg/ml；

Ps：供試品的含量，%；

Ci：雜質(zhì)的濃度，mg/ml；

Pi：雜質(zhì)的含量，%

 

由于響應(yīng)因子的測定是方法驗(yàn)證的一部分，因此應(yīng)在至少2個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證，最好使用相同的方案，以便獲得可比的結(jié)果。

 

測定中的一個(gè)限制因素通常是可用雜質(zhì)的量。雖然希望以確定作為外標(biāo)的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品相同的方式測定雜質(zhì)的含量/純度，但可用的量通常很少。于是，分析人員可自行選擇消耗少量物質(zhì)的方法，如用于測定水和/或溶劑的熱重法或庫侖法，以便仍能獲得科學(xué)有效的結(jié)果。使用不同類型的檢測器來確定響應(yīng)因子也是有益的。

 

分析人員需要考慮的另一個(gè)重要問題是測定響應(yīng)因子時(shí)雜質(zhì)和供試品的形式（堿/酸或鹽）。只要兩者以相同的形式存在，即堿/堿或鹽/鹽，就可以這樣使用樣品的稱重量，但如果存在差異，則應(yīng)在計(jì)算中引入分子質(zhì)量比的附加校正因子（折算系數(shù)）。

 

例如，如果專論物質(zhì)是堿，而雜質(zhì)是酒石酸鹽（即具有相當(dāng)大分子質(zhì)量的反離子），則應(yīng)將所稱雜質(zhì)量乘以校正因子M鹽/M堿，并針對(duì)分子質(zhì)量的差異進(jìn)行校正。

 

確定和使用響應(yīng)因子的限制和特定方面

 

不同吸收峰

 

理想情況下，雜質(zhì)和供試品的最大吸收波長應(yīng)相差不大，以便在任意物質(zhì)的最大吸收或附近指定波長測定響應(yīng)值。當(dāng)雜質(zhì)和供試品的吸收曲線相差很大時(shí)，可在供試品最大值處測量響應(yīng)，但對(duì)于雜質(zhì)，可能在吸收曲線的坡上測量。如圖1所示，在一條吸收曲線的最大值處測量意味著在第二條曲線的陡峭部分同時(shí)測量。因此，波長測量精度的微小變化可能會(huì)對(duì)雜質(zhì)測定的吸光度產(chǎn)生強(qiáng)烈影響，而供試品測定的吸光度幾乎沒有變化。

 

 

在這方面，要提及通則2.2.25.紫外和可見吸收分光光度法[7]描述了波長校驗(yàn)的允許公差，而2.2.29.液相色譜法包含一段關(guān)于檢測器的內(nèi)容，但是沒有描述對(duì)波長或吸光度的控制。

 

在貫葉金絲桃提取物（St. John’s Wort dry extract, quantified）[8]專論中可以找到這個(gè)問題的解決方法。在這篇專論中，貫葉金絲桃素的含量是用液相色譜法以指定含量的蕓香苷三水合物標(biāo)準(zhǔn)品（即蘆?。┳鳛楹繕?biāo)準(zhǔn)品測定的。為此，有必要描述貫葉金絲桃素相對(duì)于蘆丁的校正因子。貫葉金絲桃素在275nm處有最大吸收，蘆丁的紫外吸收曲線表現(xiàn)為陡峭的吸收曲線，即上述情況。

 

因此，校正系數(shù)是通過測量兩種不同波長下的響應(yīng)來確定的，蘆丁為360 nm，貫葉金絲桃素為275 nm，在色譜運(yùn)行期間（22分鐘），波長從360nm切換到275nm，以便在360nm處檢測到蘆丁和一些黃酮類化合物，在275nm處檢測到晚洗脫的貫葉金絲桃素和貫葉連翹素（圖2）。

 

 

雜質(zhì)響應(yīng)低

 

當(dāng)雜質(zhì)的響應(yīng)遠(yuǎn)低于供試品的響應(yīng)時(shí)，觀察到一個(gè)特殊的問題，即雜質(zhì)峰的面積必須乘以明顯大于1的校正因子。在這種情況下，可能會(huì)出現(xiàn)特定雜質(zhì)存在在高于報(bào)告閾值（忽略限，通常為0.05%）的水平，但由于響應(yīng)較低，相應(yīng)的峰明顯低于該極限，因此當(dāng)在應(yīng)用校正因子之前應(yīng)用報(bào)告閾值時(shí)，會(huì)忽略該峰。

 

例如，校正因子為10的雜質(zhì)可能以0.2%的水平存在，但被錯(cuò)誤地忽略，因?yàn)樵诔艘孕Ｕ蜃又?，?duì)應(yīng)的峰僅出現(xiàn)在0.02%的水平，即低于通常的報(bào)告閾值0.05%。

 

因此，在應(yīng)用報(bào)告閾值之前，必須將峰面積乘以校正因子?？稍趯Ｕ撝性O(shè)計(jì)靈敏度試驗(yàn)。為此，可以假設(shè)配制雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度相當(dāng)于雜質(zhì)忽略限，并且要求最小信噪比（S/N）為10，相當(dāng)于所得峰的定量限。如果使用自身對(duì)照溶液進(jìn)行定量，則在相當(dāng)于報(bào)告閾值的濃度下使用自身對(duì)照溶液獲得的峰的S/N應(yīng)至少為校正因子的10倍（例如校正因子為4，則S/N要求應(yīng)至少為40）。在靈敏度足夠好且雜質(zhì)峰在報(bào)告閾值處的S/N值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于10的情況下，可能不需要進(jìn)行該試驗(yàn)。

 

響應(yīng)/校正因子的使用限制

 

如上所述，需要高校正因子的低響應(yīng)雜質(zhì)，定量限可能會(huì)高于雜質(zhì)的報(bào)告閾值。在這種情況下，應(yīng)選擇不同的檢測波長。通常，當(dāng)使用高校正因子時(shí)，定量測定的準(zhǔn)確度降低，因?yàn)槎啻巫⑷霕?biāo)準(zhǔn)溶液或供試溶液的峰面積重復(fù)性對(duì)于小峰不如對(duì)于大峰好。因此，校正因子越高，測定的不確定度就越大。對(duì)于響應(yīng)因子高的雜質(zhì)，即校正因子低于1，則不會(huì)出現(xiàn)此問題。

 

因此，《歐洲藥典技術(shù)指南》[6]建議響應(yīng)因子的下限為0.2。低于此值時(shí)，應(yīng)考慮使用雜質(zhì)外標(biāo)或在不同檢測波長下進(jìn)行測量。

 

結(jié)論

 

當(dāng)有關(guān)雜質(zhì)的量足以用外標(biāo)法時(shí)，且響應(yīng)因子在0.8至1.2范圍之外時(shí)，使用響應(yīng)因子和校正因子通過液相色譜法測定雜質(zhì)是一種有價(jià)值的方法。必須特別注意正確測定響應(yīng)因子，以獲得樣品中雜質(zhì)含量測定的可靠結(jié)果。這種方法的限制條件是雜質(zhì)的響應(yīng)因子非常低，最大吸收與待測物質(zhì)相差很大。本文舉例說明如何解決這些問題。 

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] Liquid chromatography, general chapter 2.2.29.Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe; 2013.

[2] Control of impurities in substances forpharmaceutical use, general chapter 5.10. Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg,France: Council of Europe; 2013.

© Pharmeuropa | Useful information | August 2015 7

[3] Reference standards, general chapter 5.12. Ph.Eur. 8th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe; 2013.

[4] Bhattacharyya L, Pappa H, Russo KA et al. Theuse of relative response factors to determine impurities. Pharmacopeial Forum 2005; 31(3):960-6.

[5] Chromatographic separation techniques, general chapter 2.2.46. Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe;2013.

[6] Technical guide for the elaboration ofmonographs, 7th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe; 2015.

[7] Absorption spectrophotometry, ultraviolet andvisible, general chapter 2.2.25. Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg, France:Council of Europe; 2013.

[8] St. John’s Wort dry extract, quantified,monograph 1874. Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe;2013.