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摘要：報告基因法是目前發(fā)展的熱原檢測新方法，具有操作簡單、快速，不使用動物、檢測熱原譜廣，可對熱原進(jìn)行定量等優(yōu)點(diǎn)，已越來越廣泛地應(yīng)用于生物制品熱原檢測。2021年10月《體外熱原檢查法(報告基因法)》在中國藥典委網(wǎng)站公示，為更好地理解該公示稿內(nèi)容，推動該方法的實(shí)施，本文以HL60­pNL3.2報告基因熱原檢查法為例，介紹該公示稿框架和內(nèi)容，對報告基因法在生物制品中的應(yīng)用進(jìn)行了展望，以期為準(zhǔn)確應(yīng)用該方法控制相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量提供參考。

 

關(guān)鍵詞：體外熱原檢查法；報告基因法；家兔熱原檢查法；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法

 

Abstract: Reporter gene assay is a new pyrogen test developed at present. It has some advantages such as simple and fast operation, animal free, wide pyrogen spectrum and quantitation and so on, and has been more and more widely used in pyrogen detection of biological products.In vitro pyrogen test (reporter gene assay) was published for consultation on the website of the Chinese Pharmacopoeia Committee in October 2021. In order to better understand its content and promote its implementation, taking HL60pNL3.2 reporter gene assay as an example, this paper introduces the framework and content of the draft, prospects the application of the method in biological products, and provides the reference for the accurate application of the method to the quality control of related products.

 

Key words: in vitro pyrogen test; reporter gene assay; rabbit pyrogen test; bacterial endotoxin test; monocyte activation test

 

熱原是保障非腸道用藥，特別是靜脈注射用藥安全性的重要檢查項(xiàng)目之一[1]。傳統(tǒng)的檢測方法有家兔法和內(nèi)毒素檢測法，兩種方法雖是熱原檢測的經(jīng)典方法，但均存在一定的局限性[2]?；跓嵩鹑梭w發(fā)熱機(jī)理而設(shè)計(jì)的單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法，具有不使用動物、檢測熱原譜廣，可對熱原進(jìn)行定量等優(yōu)點(diǎn)[3]，該方法雖已收載于歐洲藥典(EP 10.0版)、英國藥典(BP 2021)和中國藥典(ChP 2020)，但檢測周期較長，實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣，因此需發(fā)展新的熱原檢測方法。

 

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，報告基因法因快速、靈敏、操作簡便已越來越廣泛地應(yīng)用于生物技術(shù)藥物質(zhì)量分析[4]。近年來，對于報告基因方法在熱原檢測中的研究報道也越來越多[4-­7]，但報告基因熱原檢查法目前未見收載于歐洲藥典、英國藥典、美國藥典和日本藥局方JP等各國藥典。中國食品藥品檢定研究院與上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院通過研究建立基于不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的報告基因熱原方法，共同草擬了公示稿草案，經(jīng)復(fù)核單位復(fù)核，藥典委員會專家討論后，2021年10月《體外熱原檢查法(報告基因法)》在中國藥典委網(wǎng)站公示，該公示稿不僅統(tǒng)一規(guī)范報告基因熱原檢查法，而且體現(xiàn)中國藥典標(biāo)準(zhǔn)的先進(jìn)性和創(chuàng)新性。為更好地理解該公示稿內(nèi)容，推動該方法的實(shí)施，本文以本實(shí)驗(yàn)室建立的HL60­pNL3.2報告基因熱原檢查法為例，簡介了該公示稿框架和內(nèi)容，對報告基因法在生物制品熱原測定中的應(yīng)用進(jìn)行了展望，以期為準(zhǔn)確應(yīng)用該方法控制相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量提供參考。

 

1  公示稿框架

 

《體外熱原檢查法(報告基因法)》公示稿參照《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2020年版通則9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則項(xiàng)下“單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法”體例擬定。該公示稿未規(guī)定具體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，適用于所有使用報告基因技術(shù)對熱原進(jìn)行測定的方法，從方法的原理和適用性、實(shí)驗(yàn)材料、熱原污染物限值的確定、溶液的配制、供試品干擾試驗(yàn)、測定法和結(jié)果判斷八個方面對體外熱原檢查法(報告基因法)進(jìn)行了規(guī)范。公示稿前言介紹了方法的原理和適用性；實(shí)驗(yàn)材料對實(shí)驗(yàn)所用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、試劑和材料提出明確要求；熱原污染物限值的確定、確定最大有效稀釋倍數(shù)、溶液的配制、供試品干擾試驗(yàn)和結(jié)果判斷均參照《中國藥典》2020年版“單核細(xì)胞活化反應(yīng)法”內(nèi)容擬定；測定法未規(guī)定具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，僅介紹了方法的大致流程，同時為保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，提出了系統(tǒng)適應(yīng)用性要求。

 

2  公示稿內(nèi)容淺談

 

2.1  方法原理和適用性

 

了解熱原作用機(jī)理是建立體外熱原檢查法(報告基因法)的前提。文獻(xiàn)報告[8, 9]，熱原進(jìn)入人體后，作用單核細(xì)胞上Toll樣受體(TLR)，通過相關(guān)信號(如NF­κB)通路刺激細(xì)胞分泌致炎因子，引起人體發(fā)熱。根據(jù)熱原作用機(jī)理，構(gòu)建TLR表達(dá)豐富、含熱原活化標(biāo)志物(如NF­κB)和熒光素酶報告基因質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，熱原刺激穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，由熒光素酶表達(dá)量和熱原濃度之間的量效關(guān)系，可對供試品熱原進(jìn)行定量檢測。

 

NF­κB是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，也是目前構(gòu)建適用于熱原檢測的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株常用的熱原活化標(biāo)志物，不僅在炎癥反應(yīng)，而且在免疫調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中均起重要的作用[10­-12]，因此，NF­κB信號通路的激活并非熱原特異性作用的結(jié)果?；谠摲椒ǖ奶攸c(diǎn)，公示稿明確該方法不適用于本身能刺激或抑制熱原標(biāo)志物(如NF­κB)活化的供試品。在實(shí)驗(yàn)操作中，若發(fā)現(xiàn)供試品刺激穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，有熒光素酶報告基因的表達(dá)，需用內(nèi)毒素檢查法或家兔法進(jìn)一步進(jìn)行熱原污染確認(rèn)。

 

本實(shí)驗(yàn)室前期建立了HL60­IL6單核細(xì)胞激活測定法[13-­15]，發(fā)現(xiàn)人白血病HL60細(xì)胞表面Toll樣受體2，4，6(TLR2，4和6)均表達(dá)豐富，NF­κB信號通路在HL60細(xì)胞受熱原刺激后分泌致炎因子中扮演重要的作用。根據(jù)該作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室將帶有NF­κB和熒光素酶報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HL60細(xì)胞中，構(gòu)建了HL60­pNL3.2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并研究建立了基于HL60­pNL3.2細(xì)胞的體外熱原檢查法(報告基因法)。

 

2.2  實(shí)驗(yàn)材料

 

因體外熱原檢查法(報告基因法)使用的試劑、包括細(xì)胞培養(yǎng)液、基礎(chǔ)培養(yǎng)液、顯色劑等均和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株有關(guān)，公示稿未明確具體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，規(guī)定“根據(jù)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及建立并驗(yàn)證的方法選擇適宜的細(xì)胞培養(yǎng)液、維持培養(yǎng)液和顯色劑”。本公示稿規(guī)定“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建應(yīng)符合中國藥典《基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法指導(dǎo)原則》(擬增)和《生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制》的要求”，為適用于熱原檢測的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的檢定明確了方向。同時參照EP10.0版2.6.30  Monocyte­ activation­test對單核細(xì)胞系的要求，對穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株功能性、穩(wěn)定性提出要求。參照《中國藥典》2020年版單核細(xì)胞激活測定法內(nèi)容，本公示稿規(guī)定該方法所用的所有耗材均須無熱原污染，即所用的商品化的試劑需注明無熱原，所用的耗材均需進(jìn)行去熱原處理，公示稿同時列舉了常用的去熱原方法。

 

參考《中國藥典》關(guān)于生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程和EP10.0版2.6.30 Monocyte ­Activation Test(單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法)要求，本實(shí)驗(yàn)室對HL60­pNL3.2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株功能性、無菌、支原體、外源病毒污染、TLR表達(dá)，細(xì)胞生長曲線及細(xì)胞功能穩(wěn)定性等進(jìn)行研究，結(jié)果待發(fā)表。

 

2.3  干擾實(shí)驗(yàn)

 

參照《中國藥典》2020年版“單核細(xì)胞活化反應(yīng)法”擬定干擾實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。規(guī)定供試品必須對實(shí)驗(yàn)無干擾才可以用該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行熱原測定。在實(shí)際操作中，需計(jì)算供試品最大稀釋倍數(shù)，在最大稀釋倍數(shù)內(nèi)，考察供試品對熱原檢查是否存在干擾。當(dāng)回收率在50%～200%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。當(dāng)回收率不在指定的范圍內(nèi)，須排除干擾因素，并重復(fù)干擾試驗(yàn)來驗(yàn)證處理的有效性。當(dāng)首次應(yīng)用本法進(jìn)行供試品熱原檢測時，一般需對3個批號以上的供試品進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。參照《中國藥典》通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，公示稿規(guī)定：當(dāng)供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行供試品的干擾試驗(yàn)。

 

2.4  測定法和結(jié)果判斷

 

測定法因細(xì)胞系不同而異，該公示稿未明確具體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，提出“因不同轉(zhuǎn)基因細(xì)胞測定法的試驗(yàn)參數(shù)不同，應(yīng)在試驗(yàn)前建立測定法并加以驗(yàn)證。”參照《中國藥典》和EP單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法內(nèi)容，規(guī)定至少測定三個稀釋度供試品熱原含量，且三個稀釋度供試品熱原含量均小于規(guī)定的限值(CLC)，則供試品符合規(guī)定。系統(tǒng)適用性是判斷試驗(yàn)結(jié)果是否有效的重要標(biāo)準(zhǔn)，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，參照EP和《中國藥典》單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法和報告基因法的特點(diǎn)，本公示稿擬定了系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)。

 

本實(shí)驗(yàn)室通過探討HL60­pNL3.2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株不同接種密度、熱原作用細(xì)胞不同時間，培養(yǎng)液中不同胎牛血清濃度(FBS)對試驗(yàn)結(jié)果的影響，確定了關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)參數(shù)，根據(jù)以上參數(shù)建立了基于HL60­pNL3.2細(xì)胞的體外熱原檢查法(報告基因法)[16]。參照《中國藥典》2020年版分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則對該方法進(jìn)行線性、準(zhǔn)確度、精密度等指標(biāo)驗(yàn)證。參照EP 10.0版2.6.30 Monocyte­Activation Test(單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法)cut­off值計(jì)算方式，將陰性測定信號的平均值加3SD作為Y值，代入擬合曲線中，計(jì)算相應(yīng)的熱原濃度(X值)，即為該方法檢測相應(yīng)熱原的檢測限。在該方法研究建立的過程中，發(fā)現(xiàn)每次實(shí)驗(yàn)所得內(nèi)毒素(LPS)四參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及陰性對照OD值均不相同，故每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得cutoff值和檢測限均不同。而檢測限又是進(jìn)行供試品熱原檢測時，計(jì)算供試品最大稀釋倍數(shù)最為關(guān)鍵的因素，檢測限不同將影響供試品最大稀釋倍數(shù)的計(jì)算，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤判。本實(shí)驗(yàn)室通過試驗(yàn)，確定該方法檢測限為0.05 EU·mL-1，在本實(shí)驗(yàn)室按0.05 EU·mL-1計(jì)算最大稀釋倍數(shù)。對于不同實(shí)驗(yàn)室，建議每次實(shí)驗(yàn)時設(shè)立陰性對照，并計(jì)算每次實(shí)驗(yàn)的cut­off值及檢測限，若cut­off值低于可定量范圍，則將進(jìn)行四參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的最低熱原濃度點(diǎn)作為方法檢測限，確定方法的檢測限后，再計(jì)算樣品最大稀釋倍數(shù)。

 

3  報告基因熱原測定方法在生物制品中的應(yīng)用

 

目前關(guān)于報告基因法在熱原檢測中的應(yīng)用文獻(xiàn)報告較多。2017年，Palma[7]在單核細(xì)胞系MM6中轉(zhuǎn)染了含NF­κB報告基因的質(zhì)粒，建立了一種新的報告基因熱原檢測方法。2018年，中國科學(xué)研究院的kaili Li[6]在人腺癌肺泡基底上皮A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染入含NF­κB報告基因的質(zhì)粒，構(gòu)建了適用于熱原測定的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。2019年，中國生物制品檢定研究院賀慶[5]在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染入含NF­κB報告基因，建立了基于RAW264.7細(xì)胞的報告基因熱原測定方法。

 

本實(shí)驗(yàn)室探討了HL60­pNL3.2報告基因熱原檢查法在托珠單抗、雷珠單抗和阿達(dá)木單抗等13種單抗制品，水痘疫苗、狂犬疫苗、三價流感疫苗和四價流感病毒裂解疫苗4種疫苗制品，人血白蛋白、靜注人免疫球蛋白、Ⅷ因子3種血液制品熱原測定中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)在最大稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)，除1種單抗制品外，熱原在其他19種生物制品中的回收率均在50%～200%之間，HL60pNL3.2報告基因熱原檢查法可用于該19種生物制品熱原測定。其中對熱原存在干擾的1種單抗制品，在最大稀釋倍數(shù)內(nèi)，熱原回收率低于 50%(n=3)，表明該方法不適用于該單抗熱原檢測，存在干擾的原因需進(jìn)一步探討研究。

 

4  結(jié)語與展望

 

基于我國現(xiàn)階段的實(shí)際情況，并控制體外熱原檢查法(報告基因法)的初期應(yīng)用風(fēng)險，該公示稿僅將體外熱原檢查法(報告基因法)作為熱原檢查的補(bǔ)充方法，未強(qiáng)制該方法的執(zhí)行。

 

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，新型生物制品如細(xì)胞制品不斷獲批上市。2021年，兩款CAR­T(Chimeric Antigen Receptor T­Cell)細(xì)胞治療產(chǎn)品在國內(nèi)獲批上市，為淋巴瘤患者帶來福音，同時熱原檢測對保證該類細(xì)胞制品安全性至關(guān)重要。因細(xì)胞制品生產(chǎn)工藝特殊、生產(chǎn)經(jīng)過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，體外擴(kuò)增，最終回輸入血等一系列過程，涉及環(huán)境復(fù)雜，僅對其進(jìn)行內(nèi)毒素控制，無法保證產(chǎn)品的安全性，而家兔法需要供試品量大，實(shí)驗(yàn)成本高，供試品本身可能引起家兔體溫升高，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在干擾。而且該類產(chǎn)品有效期短，病人需求急，需快速放行，體外熱原檢查法(報告基因法)適合該類制品的熱原檢測。另外，腺病毒載體疫苗、核酸疫苗和基因治療制品都是目前研究的熱點(diǎn)，體外熱原檢查法(報告基因法)在該類制品熱原檢查中具有良好的應(yīng)用前景。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1]  李冠民，黃清泉. 熱原檢查的研究進(jìn)展及有關(guān)問題的探討[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)雜志，2002，12(4)：232

 

LI GM, HUANG QQ. Research progress and discussion on pyrogen examination[J]. J Exp Zool, 2002, 12(4)：232

 

[2]  郭春雪. 熱原及其檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 科技資訊， 2015, 13(5)：216

 

GUO CX. Research progress of pyrogen and its detection methods[J]. Sci Technol Inf, 2015, 13(5)：216

 

[3]  賀慶， 高華. 單核細(xì)胞熱原檢測法的設(shè)計(jì)與應(yīng)用要點(diǎn)分析[J]. 中國生物制品學(xué)雜志， 2020, 33(8)：961

 

HE Q, GAO H. Analysis on design and application of monocyte pyrogen assay[J]. Chin J Biol, 2020, 33(8)：961

 

[4]  劉荔楨， 王燦， 邵泓. 報告基因法在生物技術(shù)藥物活性檢測中的應(yīng)用[J].中國藥師，2021，24(7)：349

 

LIU LZ，WANG C, SHAO H. Application of reporter gene assay in bioactivity detection of biotechnological drugs[J]. China Pharm, 2021, 24(7)：349

 

[5]  HE Q, YU C, WANG L, et al. A Novel Reporter Gene Assay for Pyrogen Detection[J]. Jpn J Infect Dis,2020, 73(2)：111

 

[6]  LI K, XU H, JIANG W, et al. Development and characterization of stable reporter cells for fast and sensitive detection of pyrogen[J]. Anal Biochem, 2018, 557：69

 

[7]  PALMA L, ROSSETTI F, DOMINICI S, et al. Determination of Interference During In Vitro Pyrogen Detection:Development and Characterization of a Cell­Based Assay[J]. Assay Drug Dev Technol, 2017, 15(2)：64

 

[8]  ANTHONEY N, FOLDI I, HIDALGO A. Toll and Toll­like receptor signalling in development[J]. Development, 2018, 145(9): 156018

 

[9]  王鳴人， 王燦， 陳鋼. 熱原誘導(dǎo)的Toll樣受體信號傳導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J]. 中國藥師，2018，21(3)：480

 

WANG MR, WANG C, CHEN G. Advances in Tolllike receptor signaling pathway induced by pyrogens[J]. China Pharm,2018, 21(3)：480

 

[10]  LAWRENCE T. The nuclear factor NF­kappaB pathway in inflammation[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2009, 1(6)：a001651

 

[11]  LIANG H, YANG X, LIU C, et al. Effect of NF­κB signaling pathway on the expression of MIF, TNFalpha, IL6 in the regulation of intervertebral disc degeneration[J]. J Musculoskelet Neuronal Interact, 2018, 18(4)：551

 

[12]  DOLCET X, LLOBET D, PALLARES J, et al. NF­κB in development and progression of human cancer [J]. Virchows Arch, 2005, 446(5)：475

 

[13]  WANG C, WANG MR, LI GM, et al. The application of HL60IL6 assay for in vitro pyrogen detection of CART cells products [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2021, 22(1)：176

 

[14]  WANG C, ZHAO HB, WANG ZQ, et al. A novel monocytebased pyrogen test based on the mechanism of Human fever reaction [J]. Curr Pharm Anal, 2016, 12(3)：227

 

[15]  董閃閃，王燦，周勤，等. 單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)在疫苗類生物制品熱原檢測中的應(yīng)用研究[J].中國藥師，2016，19(5)：870

 

DONG SS, WANG C, ZHOU Q, et al. Application of monocyte activation test in pyrogen detection of vaccine biological products[J]. China Pharm, 2016, 19 (5): 870