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摘要  

 

系統(tǒng)適用性是色譜工作中必不可少的部分，國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)都對系統(tǒng)適用性試驗做了要求。本文是筆者對色譜實驗中系統(tǒng)適用性的漫談，供廣大讀者在工作閑暇之處討論，不足之處還望理解。

 

系統(tǒng)適用性是液相和氣相色譜方法的重要組成部分，用來確認色譜系統(tǒng)的分離度和重復(fù)性能夠滿足特定的分析要求。測試是基于將儀器、電路、實驗者和樣品作為一個整體進行的。

 

美國藥典規(guī)定任何色譜試驗一定要進行系統(tǒng)適用性測試，否則，這臺儀器做出的數(shù)據(jù)一律無效；ICH提出一定要將系統(tǒng)作為整體來測試；FDA提到應(yīng)確定一SOP進行測試確保系統(tǒng)可用；英國藥典規(guī)定建立系統(tǒng)適用性是為了任何使用方法時都是有效的；歐洲藥典提出系統(tǒng)適用性測試反映了色譜系統(tǒng)性能，是建立分析方法不可或缺的一部分；日本藥典與美國藥典敘述基本一致；GMP指出檢查分析方法驗證過程時，應(yīng)涉及是否開發(fā)了系統(tǒng)適用性試驗，并且對每一項系統(tǒng)適用性試驗的參數(shù)都進行了定義；中國藥典并沒有單獨對系統(tǒng)適用性目的進行敘述，國內(nèi)色譜工作者往往對系統(tǒng)適用性不夠重視，看似簡單的系統(tǒng)適用性其實有很多需要關(guān)注的地方，其重要性不比方法學(xué)中其他驗證項差。

 

一、美國藥典系統(tǒng)適用性的要求

 

美國藥典并沒有明確對分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子、重復(fù)性及靈敏度的統(tǒng)一要求，在藥典正文中各個品種項下分別規(guī)定。當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液需要重復(fù)進樣以判斷系統(tǒng)的精密度，除非個論中有規(guī)定，系統(tǒng)適用性5針的數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不得超過2.0%，當(dāng)超過2.0%時，需要計算連續(xù)6針進樣的數(shù)據(jù)。在含量測定中，系統(tǒng)適用性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差與進樣次數(shù)和含量限度上限有關(guān)，表1是USP對含量系統(tǒng)適用性測試相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的規(guī)定。

 

表1 USP對含量系統(tǒng)適用性RSD的要求

 

含量限度上限	進樣次數(shù)
	3	4	5	6
	RSD%
101.0%				0.349
102.0%	0.41	0.59	0.73	0.85
102.5%	0.52	0.74	0.92	1.06
103.0%	0.62	0.89	1.10	1.27

 

關(guān)于對稱因子規(guī)定參考筆者撰寫《拖尾因子、對稱因子和不對稱因子區(qū)別理論》，在此不做贅述。當(dāng)系統(tǒng)適用性不符合要求時可以適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，不過每個變量的最大值都應(yīng)該進行驗證其系統(tǒng)適用性，對改變后的方法進行重新評價。表2是USP對參數(shù)調(diào)整的規(guī)定。

 

表2 USP對系統(tǒng)參數(shù)再調(diào)整的規(guī)定

 

參數(shù)	規(guī)定變化量
一般是不推薦改變流動相組分，調(diào)整比例即可	僅能對最小溶劑組分的量進行改變，不得超過相對量的±30%或絕對量的±10%
流動相pH值	正負0.2個單位
在滿足pH值得情況下，緩沖鹽濃度波動范圍	±10%
色譜柱長度	±70%
液相色譜柱內(nèi)徑	與流速配合調(diào)整
氣相毛細管柱內(nèi)徑	±50%
液相色譜柱填料±粒徑	可以減少50%，但不能增大
氣相毛細管柱填料粒徑	根據(jù)需求增大或減少
氣相柱流量	±50%
液相流速	與色譜柱內(nèi)徑配合調(diào)整
波長	不能做調(diào)整
液相進樣體積	可以減少，但不能增加
氣相進樣體積	可以適當(dāng)增大或減少
柱溫	±10%
進樣口溫度	±10%
程序升溫	±20%

 

二、歐洲藥典和英國藥典系統(tǒng)適用性的要求

 

歐洲藥典和英國藥典對系統(tǒng)適用性要求也做了非常詳細的規(guī)定，并且對保留時間、保留體積、死體積、死時間等概念做了詳細描述。EP和BP關(guān)于對稱因子規(guī)定參考筆者撰寫《拖尾因子、對稱因子和不對稱因子區(qū)別理論》，在此不做贅述。系統(tǒng)適用性5針的數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差與USP規(guī)定基本一致。當(dāng)系統(tǒng)適用性不符合要求時可以適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，EP和BP對等度洗脫和梯度洗脫分別做了規(guī)定，詳見表3。

 

表3 EP和BP對系統(tǒng)參數(shù)再調(diào)整的規(guī)定

 

類型	參數(shù)	規(guī)定變化量
等度洗脫	流動相組分	最小溶劑組分的量改變時，不得過相對量的±30%，或者絕對量的±2%，以數(shù)字大者為準(zhǔn)，但不得過±30%
	流動相pH值	正負0.2個單位
	流速	±50%，可以隨柱尺寸改變
	柱參數(shù)	固定相不得改變，粒徑可以減少50%，不得增加
	柱尺寸	長度改變±70%，內(nèi)徑可以改變±25%
	柱溫	±10℃
	波長	不得改變
	進樣量	可以減少，不得增加
梯度洗脫	流動相組分	更換后組分洗脫能力要增強，主峰保留時間改變±15%
	流動相pH值	不得改變
	流動相鹽濃度	±10%
	流速	與等度洗脫一致
	柱尺寸	固定相不得改變，粒徑不得改變，長度和內(nèi)徑與等度一致
	柱溫	±5℃
	波長	不得改變
	進樣量	與等度一致
氣相	毛細管柱粒徑	可減少50%，但不能增大尺寸
	毛細管柱膜厚	-50%~+100%
	毛細管長度	±70%
	內(nèi)徑	±50%
	柱流量	±50%
	柱溫	±10%
	進樣體積	根據(jù)需求可以增大或減少

 

三、日本藥典系統(tǒng)適用性要求

 

日本藥典要求在液相中的系統(tǒng)適用性一般重復(fù)進樣6次，需要根據(jù)實際情況確定適合的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。比如6次進樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.0%，則要求雜質(zhì)含量不得大于5.0%，含量應(yīng)在98.0%~102.0%范圍內(nèi)。雜質(zhì)含量在0.5%~1.0%范圍內(nèi)，則要求系統(tǒng)適用性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%。不過，在利用梯度方法或者樣品包含強保留組分時，可以適當(dāng)減少進樣次數(shù)來確定新的接受限度以滿足系統(tǒng)適用性，表4是不同進樣次數(shù)對應(yīng)6次進樣的限度規(guī)定。

 

表4 不同進樣次數(shù)對應(yīng)6次進樣的限度規(guī)定

 

進樣次數(shù)	RSD%
6	1%	2%	3%	4%	5%	10%
5	0.88%	1.76%	2.64%	3.52%	4.40%	8.81%
4	0.72%	1.43%	2.15%	2.86%	3.58%	7.16%
3	0.47%	0.95%	1.42%	1.89%	2.37%	4,73%

 

上述要求均指在液相中，對于氣相色譜可以適當(dāng)放寬。JP并沒有單獨對理論塔板數(shù)、拖尾因子及分離進行規(guī)定，而是在藥典正文各個品種下進行規(guī)定。當(dāng)系統(tǒng)適用性不符合要求時可以適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，JP并沒有像USP、EP及BP一樣進行詳細規(guī)定，只是簡單敘述可以從色譜柱、流動相、柱溫等進行改變以適應(yīng)系統(tǒng)適用性要求。

 

四、中國藥典系統(tǒng)適用性的要求

 

中國藥典要求定量分析時，分離度應(yīng)大于1.5。進行重復(fù)性分析，采用外標(biāo)法時，取對照品溶液連續(xù)進樣5次，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%，采用內(nèi)標(biāo)法時，配制80%、100%和120%對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%。拖尾因子規(guī)定參考筆者撰寫《拖尾因子、對稱因子和不對稱因子區(qū)別理論》，在此不做贅述。當(dāng)系統(tǒng)適用性不符合要求時可以適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，ChP同樣對參數(shù)改變做了要求。表5是ChP對系統(tǒng)參數(shù)在調(diào)整規(guī)定。

 

表5  ChP 對系統(tǒng)參數(shù)在調(diào)整規(guī)定

 

參數(shù)	規(guī)定變化量
固定相種類	不可變化
流動相種類	不可變化
檢測器類型	不可變化
流動相比例	以組分比例較低者（小于等于50%）相對于自身的該變量不超過±30%，改變總量不超過±10%，總量以10%為限
進樣量	根據(jù)需求改變
柱溫	根據(jù)需求改變
色譜柱尺寸	根據(jù)需求改變
流速	根據(jù)需求改變

 

五、筆者對系統(tǒng)適用性的要求

 

筆者在進行系統(tǒng)適用性試驗時會依據(jù)情況而定，如果含量和有關(guān)物質(zhì)是一種方法，則只需要進行系統(tǒng)適用性試驗。反之，則應(yīng)區(qū)別對待。對于含量的系統(tǒng)適用性試驗應(yīng)配制規(guī)定樣品濃度的主成分，添加所有已知雜質(zhì)進樣6次重復(fù)進樣試驗，首先要求6次進樣的雜質(zhì)與主成分的分離度均大于2.0，并且主成分的拖尾因子應(yīng)在0.95~1.05之間，理論塔板數(shù)可根據(jù)實際情況酌情而定（比如色譜柱性能變差則峰形變平等等）。再者就是6次進樣的主成分的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.0%，保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.0%。

 

對于等度洗脫方法或者已確定各雜質(zhì)保留時間足夠穩(wěn)定，可以采用上述混合溶液單針進樣，考察分離度、理論塔板數(shù)及拖尾因子，再以主成分對照品溶液行3次連續(xù)進樣兩兩計算峰面積及保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于1.0%，或者6次連續(xù)進樣的峰面積及保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于1.0%以確定系統(tǒng)滿足測定要求。有關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)適用性應(yīng)制備混有至少大于限度濃度雜質(zhì)的主成分對照品溶液進行1次進樣，根據(jù)實際情況確定分離度、拖尾因子及理論塔板數(shù)要求，再按照含量系統(tǒng)適用性測試中對照品方法進行測定即可。

 

系統(tǒng)適用性樣品

 

系統(tǒng)適用性應(yīng)使用經(jīng)過確認的一級或二級對照品和任何必要的物料進行系統(tǒng)適用性檢查，以確保足夠的方法性能。一個新批次高度純化的對照物料（例如來自化學(xué)品供應(yīng)商或自制）應(yīng)采用一級對照品進行確認。未確認為對照品的制劑或API不應(yīng)用于系統(tǒng)適用性測試。即使API或制劑經(jīng)過恰當(dāng)確認成為對照品，如果是來自待檢樣品相同批次，則亦不能用于系統(tǒng)適用性測試。所以我們?nèi)粘Ｋ幬锓治龉ぷ髦惺遣荒苡霉┰嚻纷鳛橄到y(tǒng)適用性樣品的，采用供試品進行系統(tǒng)適用性測試具有直到檢測合格為止的嫌疑。 

 

系統(tǒng)適用性試驗什么時候做

 

何時進行系統(tǒng)適用性因人而異，每個人都有一套自己的標(biāo)準(zhǔn)，筆者認為在系統(tǒng)發(fā)生變動時都要進行系統(tǒng)適用性試驗（比如新配制流動相、比如更換同型號新購色譜柱、比如更換氣體），還有在長時間進行運行樣品時也及時進行系統(tǒng)適用性封針操作。方法驗證試驗一定包括系統(tǒng)適用性測試。正如前文所說，沒有進行系統(tǒng)適用性試驗的系統(tǒng)任何數(shù)據(jù)都是無效的。

 

 結(jié)語 

 

系統(tǒng)適用性試驗作為分析方法不可分割的一部分，已經(jīng)被越來越多的監(jiān)管機構(gòu)所重視。不過從目前國內(nèi)整體的藥物研發(fā)情況來看，藥物分析工作者對此還沒有足夠的認識，未結(jié)合分析方法驗證情況有針對性地去探索系統(tǒng)適用性試驗的要求。在有藥典參考標(biāo)準(zhǔn)的情況下，對藥典標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)適用性要求不夠重視，僅僅將色譜條件拿來使用，或者隨意更改、降低系統(tǒng)適用性要求，導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性差，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。在這方面，藥物分析工作者們急需提升觀念，提高重視程度，加強研究。

 

參考文獻

 

【1】美國藥典

【2】歐洲藥典

【3】英國藥典

【4】日本藥典

【5】中國藥典

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【7】《Data Integrity and Compliance With Drug CGMP》

【8】李飛, 李云, 許真玉. 色譜系統(tǒng)適用性試驗在分析方法使用中的重要性[J]. 中國新藥雜志, 2019, 28(06):30-33.