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側(cè)向層析膜，到底是個(gè)啥？

 

NC（Nitrocellulose，硝酸纖維素）膜在免疫層析檢測(cè)技術(shù)起著至關(guān)重要的作用。因其具有高蛋白結(jié)合能力和優(yōu)秀的層析性能，可用作免疫層析檢測(cè)試劑中檢測(cè)線T和質(zhì)控線C的固相支撐介質(zhì)。通過免疫反應(yīng)顯色，用戶可以直接在膜上判讀結(jié)果。

 

 

NC膜原材料來自棉花

 

 

放大500倍 和 2000倍的膜的照片

 

 

早孕棒約判讀窗口寬度的1/50放大

 

 

除了核酸，你有聽到過檢測(cè)新冠的抗原檢測(cè)試劑嗎？雖病毒比膠體金微球還大，不管是整顆的病毒，還是分散的零件，統(tǒng)統(tǒng)拿下。

 

 

除了膠體金微球上要裹上抗體，膜上也要。。按個(gè)算，1平方cm要包裹1.2億個(gè)抗體！

 

 

只要抗體沒有過量，那么噴灑抗體的管線與膜接觸的越少就越細(xì)。

 

 

NC膜如何評(píng)估

 

通常通過以下幾個(gè)方面

 

外觀

 

外觀可在光源下進(jìn)行目視檢查。膜表面如果不平整、光滑，有異物、粉塵、針眼、劃痕或壓痕等缺陷，一方面會(huì)影響C/T線質(zhì)量，造成斷線、粗細(xì)不均等缺陷；另一方面，則會(huì)影響液體在膜內(nèi)的流動(dòng)，導(dǎo)致液流不規(guī)則。

 

 

質(zhì)量合格的膜

 

 

有缺陷的膜

 

劃膜缺陷示意

 

厚度

 

厚度可采用測(cè)厚儀進(jìn)行測(cè)量，在NC膜上選擇幾個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量以考察其均勻性。厚度若不均勻，會(huì)導(dǎo)致劃出來的C/T線寬窄不一。在捕獲試劑用量不變的情況下，膜越厚C/T線越窄，反之亦然。

 

 

幅寬

 

幅寬可采用普通直尺或游標(biāo)卡尺測(cè)量。常用的幅寬有20mm和25mm兩種規(guī)格，廠家可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)工藝的需求進(jìn)行選擇，特殊的規(guī)格也可與供方協(xié)商定制。

 

背襯

 

NC膜有無背襯和帶背襯兩種類型。由于材質(zhì)本身特性，無背襯NC膜很脆，容易破裂，加工過程存在一定的難度。帶背襯NC膜是直接將硝酸纖維素聚合物澆筑在透明的基帶上成型后得到。

 

得益于背襯的存在，一方面使得NC膜強(qiáng)度得到提高，易于生產(chǎn)、加工操作；另一方面，在粘貼到PVC膠板后，背襯可以有效地阻隔膠內(nèi)物質(zhì)遷移進(jìn)入NC膜，避免對(duì)性能造成影響。

 

爬速

 

起泡點(diǎn)測(cè)試是表征濾膜孔徑最常用的方法，但是它只適用于測(cè)定垂直流動(dòng)方向的膜孔徑，對(duì)測(cè)定側(cè)向流動(dòng)方向的膜孔徑并不適用。

 

目前，行業(yè)內(nèi)統(tǒng)一采用爬速測(cè)試的方法來表征側(cè)向流動(dòng)方向的膜孔徑。爬速可以用秒表測(cè)定純化水從膜的底部通過毛細(xì)作用“爬”到4cm頂端所用的時(shí)間（s）得到。根據(jù)爬速的不同，NC膜一般可分為快流速、中流速和慢流速三類。流速越快，意味著孔徑越大。

 

 

爬速測(cè)試示意

 

爬速是非常重要的指標(biāo)，其影響主要包括：

 

1）一定范圍內(nèi)，流速越快，檢測(cè)時(shí)間越短；

 

2）流速加快，反應(yīng)時(shí)間縮短，分析物表觀濃度降低，導(dǎo)致靈敏度降低；

 

3）流速越慢，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大。

 

所以，實(shí)際在開發(fā)免疫層析檢測(cè)試劑時(shí)需要綜合考慮上述影響以達(dá)到性能的最佳平衡。

 

 

蛋白吸附

 

如何將捕獲分子持續(xù)、牢固的結(jié)合在檢測(cè)線T和質(zhì)控線C，是生產(chǎn)一個(gè)靈敏、可靠的免疫層析檢測(cè)試劑的關(guān)鍵。雖然NC膜自第一次制備以來至今已有一百余年，但是其與蛋白結(jié)合的真實(shí)機(jī)理科學(xué)家們?nèi)晕催_(dá)成共識(shí)。目前普遍認(rèn)同的是，NC膜與蛋白的結(jié)合是彼此之間疏水作用力、氫鍵以及靜電吸力三者共同作用的結(jié)果。蛋白與膜結(jié)合能力的強(qiáng)弱將直接影響檢測(cè)靈敏度和C/T線的寬度。

 

一般來說，影響NC膜和蛋白結(jié)合的因素包括：

 

1）制膜材料本身的性質(zhì)；

 

2）比表面積；

 

3)  表面活性劑的含量。

 

制膜材料的影響；不同廠家生產(chǎn)的NC膜雖然都是由硝酸纖維素制成，但是不同原材料在性能上存在一定差異，會(huì)導(dǎo)致與蛋白的結(jié)合能力有不所同。

 

比表面積；比表面積越大，意味著膜內(nèi)聚合物表面積越大，可與蛋白進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)越多，蛋白結(jié)合能力越強(qiáng)。

 

表面活性劑含量；表面活性劑對(duì)NC膜起到潤(rùn)濕的作用，但是濃度過高則可能會(huì)影響NC膜與蛋白的結(jié)合。

 

 

除了按供方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)方法對(duì)NC膜的各項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證外，POCT廠商還可以結(jié)合自己的生產(chǎn)工藝對(duì)其性能(如靈敏度、特異性等)進(jìn)行確認(rèn)，從而選擇一款滿足實(shí)際生產(chǎn)需求的NC膜。

 

NC膜，如何選用和質(zhì)檢

 

1，膜的規(guī)格

 

如何選擇膜？經(jīng)常會(huì)遇到的問題是，我是做什么項(xiàng)目的，我該選擇那類膜？

 

這里涉及到一個(gè)膜的分類標(biāo)準(zhǔn)問題，一個(gè)供應(yīng)商可能提供這個(gè)膜是8um，但另一個(gè)供應(yīng)商告訴你膜是135s的。這之間的區(qū)別與聯(lián)系是什么？

 

um指的是膜孔徑，而膜的孔徑實(shí)際上是沒有辦法界定的。由于干燥成型等過程的非絕對(duì)均一，膜的孔徑也是非均一的。膜孔徑的說法實(shí)際上是沿用了一直以來的一個(gè)形象稱呼。

 

而以秒為單位的定義為，純水層析4cm膜的時(shí)間。該單位已經(jīng)被各大廠商所接受，成為了一個(gè)通用的比較標(biāo)準(zhǔn)。以下我們將采用s單位來進(jìn)行交流。

 

換算情況大致為：8um=135s；6um=180s

 

2，不同秒數(shù)的膜對(duì)反應(yīng)有什么影響

 

首先，我們分析一下液體在膜上的運(yùn)動(dòng)過程。一張長(zhǎng)度為4cm的膜， 每隔1cm做一個(gè)標(biāo)記， 當(dāng)液體運(yùn)動(dòng)過標(biāo)記處時(shí)記錄時(shí)間點(diǎn). 那么你將會(huì)發(fā)現(xiàn)液體在膜上的運(yùn)動(dòng)是呈減速前行的。

 

而兩張不同秒數(shù)的膜（例如135s， 180s）在同一時(shí)間標(biāo)記點(diǎn)處的運(yùn)動(dòng)速度不同.這個(gè)試驗(yàn)用清水做不好觀察，可以考慮用色素水溶液，非常明顯。

 

那么從這個(gè)試驗(yàn)可以看出，在通過同一T線噴點(diǎn)位置時(shí)，金溶液通過的速度是快速膜大于慢速膜。

 

那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。

 

同時(shí)還有一個(gè)問題是，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。

 

所以這里就有一個(gè)讀數(shù)時(shí)間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡。

 

其實(shí)我們并沒有那么多選擇。經(jīng)過使用實(shí)踐，各供應(yīng)商一般都只提供兩個(gè)型號(hào)，就是135s和180s。雖然看到有些廠家的產(chǎn)品目錄上型號(hào)種類繁多，但這兩個(gè)型號(hào)的定貨量就占了95%以上，其他型號(hào)供貨上也就遠(yuǎn)不如這兩個(gè)型號(hào)來得順利。

 

你所要做的是，先選擇其中的一個(gè)型號(hào)， 然后比較不同供應(yīng)商同一個(gè)型號(hào)的差異，由于前面說的添加配方與你的試驗(yàn)條件配合的不同，這個(gè)差異可能大也可能小。具體要根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來確定最后的選擇。

 

3，質(zhì)控

 

對(duì)于一卷膜可以用上幾個(gè)月的用戶來說，廠家的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)完全能滿足你的要求，而不需要自己再做相關(guān)的質(zhì)控。

 

膜的質(zhì)控雖屬于原輔料QC職能，但由于其專業(yè)性強(qiáng)，一般都由小樣調(diào)試人員來執(zhí)行。膜入原料庫(kù)后需要進(jìn)行如下檢驗(yàn)工作：

 

3.1 查收COA

 

在購(gòu)買時(shí)， 供應(yīng)商會(huì)隨產(chǎn)品為每個(gè)lot的膜提供一張紙質(zhì)的出廠質(zhì)量證書， 該證書被稱為COA。

 

如果你已經(jīng)購(gòu)買某一批次的膜， 而沒有索取相應(yīng)的證書， 如果有需要可提供批號(hào)向廠家要求補(bǔ)發(fā)。其實(shí)在很多行業(yè)都有廠商為自己的產(chǎn)品附上COA的習(xí)慣。

 

3.2 檢查物理性能

 

膜的物理性能主要是2個(gè)參數(shù)， 膜厚度和寬度。

 

長(zhǎng)度不需要檢測(cè)。使用中可以關(guān)注長(zhǎng)度上是否有斷面重接現(xiàn)象， 斷面多費(fèi)料則多， 少數(shù)發(fā)生。

 

厚度，由螺旋測(cè)微尺，選擇幾個(gè)測(cè)量點(diǎn)檢測(cè)后算平均。膜生產(chǎn)的必測(cè)參數(shù)。主要表現(xiàn)為厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴(kuò)散性能，點(diǎn)出來的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速。

 

寬度，普通直尺測(cè)量。物理性能一般都不會(huì)有什么大問題。畢竟檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)客觀，易把握。沒有條件執(zhí)行的廠家可省略。

 

3.3 跑水性能

 

樣本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易觀測(cè)，需制作一個(gè)簡(jiǎn)易支架。

 

操作：注入足夠溶液到下部槽內(nèi)，將不同批次膜每隔1cm做一次標(biāo)記（總長(zhǎng)大于4cm）并放到傾斜支架，整個(gè)支架下端放入溶液槽，膜開始吸液，計(jì)時(shí)。

 

記錄每個(gè)標(biāo)記處的通過時(shí)刻，并與對(duì)照組比較。跑板時(shí)，理論上溶液呈水平線形式上吸，觀測(cè)是否有波浪傾斜或包圍潤(rùn)濕等反常現(xiàn)象。

 

3.4 點(diǎn)樣測(cè)試

 

C/T線出線時(shí)間，其他試驗(yàn)條件相同情況下，記錄和比較C/T線出現(xiàn)時(shí)間是否與對(duì)照有差異。

 

靈敏度，比較不同樣本濃度情況下，T線的變化是否和對(duì)照組同。一般每批次膜取前端一段用來測(cè)試即可。

 

由于制造過程的不均一性， 不同批號(hào)的靈敏度會(huì)有一定差異，當(dāng)大批量使用時(shí)，這種差異影響是非常大的，那么就要按照靈敏度表現(xiàn)將不同批號(hào)的膜進(jìn)行分類。

 

當(dāng)進(jìn)入后期生產(chǎn)調(diào)用時(shí)，就能根據(jù)這些分類，按照訂單要求取用不同批號(hào)的膜，或者用強(qiáng)靈敏度的原料和差靈敏度的膜來搭配。

 

關(guān)于膜的批內(nèi)差。批內(nèi)差是肯定存在的，只是差距大小的問題，依據(jù)一般的測(cè)試條件是很困難獲得詳細(xì)的數(shù)值，因?yàn)槟悴豢赡軐?duì)每一卷膜的每一段都做詳細(xì)的測(cè)試。

 

減小膜批內(nèi)差的最有效方法是不購(gòu)入邊緣膜帶。膜生產(chǎn)出的半成品是寬幅很大的一個(gè)膜面，要通過截面裁切才能獲得25mm或者20mm的寬度。

 

那么就有中間部分，和邊緣部分之分.越靠近中間部分，膜的均勻性越好，邊緣部分則相對(duì)要差，就造成了批內(nèi)差。

 

一般可以通過COA獲得具體位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A，B，C……來表示切出的窄膜在寬幅膜中的位置。

 

如果是試用某個(gè)型號(hào)的膜小樣，還需要在以上檢測(cè)后加入膜加速老化試驗(yàn)，包括膜單獨(dú)的老化試驗(yàn)和點(diǎn)好膜后產(chǎn)品的老化試驗(yàn)。