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可見異物系指存在于注射劑、眼用液體制劑和無菌原料藥中，在規(guī)定條件下目視可以觀察到的不溶性物質(zhì)，其粒徑或長度通常大于50 μm[1]?？梢姰愇锏谋O(jiān)控是保證注射劑安全使用的一項重要指標，由于注射劑的給藥途徑為靜脈注射或肌內(nèi)注射，而人體微循環(huán)血管的直徑只有7 ～ 12 μm，一旦可見異物或不溶性微粒被注射入人體，不僅影響藥物的治療效果，甚至會引發(fā)靜脈炎、休克、血栓、過敏等癥狀，嚴重影響患者的生命安全[2]。

酮咯酸氨丁三醇(ketorolac tromethamine，1)為臨床常用的非甾體類抗炎藥，通常用于手術(shù)后鎮(zhèn)痛。1 注射液自上市以來，一直存在含有顆粒物的問題，如英國Hospira 公司等曾在全球范圍內(nèi)召回多批次注射液，召回原因為注射液中含有顆粒物。可見異物可導致局部炎癥、過敏反應、肉芽腫形成或微栓塞效應，具有一定的安全隱患[3—4]。目前，國內(nèi)藥物研發(fā)機構(gòu)對可見異物成因及監(jiān)控方法的認知水平均較低，本研究嘗試采用先進的分析儀器對1 注射液中的可見微粒進行定性分析，以期為未來研發(fā)過程中可見微粒的成因及控制方法研究提供參考。

1、儀器與試藥

YB- Ⅱ型澄明度檢測儀( 天津市光學儀器廠) ；AvanceⅢ 400 MHz 型核磁共振譜儀和XFlash630 型能譜儀均購于德國Bruker 公司；SQD2 型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀( 美國Waters 公司) ；LAMBDA 365 型紫外- 可見分光光度計( 美國PerkinElmer 公司) ；Nicolet IS10 型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR) 儀( 美國Thermo Fisher Scientific 公司) ；Q45 型掃描電鏡( 美國FEI 公司) ；1 注射液[ 山東新時代藥業(yè)有限公司， 批號180401( 用于收集可見微粒，所得可見微粒為受試樣品)、F1903021-1] ；1 注射液( 廠家A，批號93090DK) ；氘代二甲基亞砜(DMSO-d6，美國CIL 公司，純度99.9％，批號PR30847/04309DM1) ；甲醇為色譜純；玻璃安瓿( 山東力諾玻璃制品有限公司，批號19010209-02、19010209-01、18120212) ；聚丙烯(PP) 安瓿( 山東華魯制藥有限公司，批號F1903021、F1903031、F1903041)。健康雄性日本大耳兔12 只，體質(zhì)量2 160 ～ 2 564 g，年齡104 ～ 134 d，購于邳州市東方養(yǎng)殖有限公司，動物合格證號201920159，本試驗涉及的動物試驗的相關(guān)內(nèi)容和程序均由國家倫理委員會批準。

2、方法與結(jié)果

2.1 可見微粒的分析表征

取1 注射液( 批號180401)，置2 ～ 8 ℃環(huán)境中貯存，放置12 個月后，匯總注射液，過濾，收集濾出物，即為可見微粒，作為受試樣品，干燥后進行下述表征分析。2.1.1 紫外- 可見吸收光譜(UV-Vis) 分析將受試樣品溶解于甲醇中，配制成質(zhì)量濃度約為9.7 μg/ml 的溶液，進行UV-Vis 吸收光譜掃描( 掃描范圍200 ～ 800 nm)。其UV-Vis 吸收譜圖見圖1，受試樣品的甲醇溶液在241 nm 處有弱的吸收峰，為酮基取代苯產(chǎn)生的E2 帶紅移；在317 nm 處有強的吸收峰，為共軛結(jié)構(gòu)π-π* 躍遷吸收，峰位穩(wěn)定，說明樣品分子結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)和共軛結(jié)構(gòu)。

2.1.2 FT-IR 分析

采用溴化鉀壓片法將受試樣品進行壓片后，進行FT-IR 分析，設(shè)置分辨率為4.0 cm–1，掃描次數(shù)為16。結(jié)果如圖2 所示，樣品分子結(jié)構(gòu)中含有痕量水、游離酸、芳環(huán)、亞甲基、酮基、羧酸鹽和碳氮鍵結(jié)構(gòu)，具體數(shù)據(jù)分析見表1。

2.1.3 掃描電子顯微鏡- 能譜(SEM-EDS) 分析

按照GB/T 17359-2012 微束分析能譜法對受試樣品進行定量分析，設(shè)置參數(shù)High voltage 為15.0 keV。受試樣品的電鏡能譜分析測試圖見圖3 ～ 4，數(shù)據(jù)分析見表2。結(jié)果表明，樣品中含有鈣元素。

2.1.4 質(zhì)譜(MS) 分析

將受試樣品制成甲醇稀溶液，按照《中華人民共和國藥典》2020 年版(ChP 2020) 四部通則0431質(zhì)譜法進行檢測，設(shè)置離子模式為電噴霧離子源(ESI)，掃描方式為全掃描模式。受試樣品在正離子模式及負離子模式下的MS 測試圖見圖5，數(shù)據(jù)分析見表3。結(jié)果顯示，正離子模式下的質(zhì)譜出峰(256.2) 和負離子模式下的質(zhì)譜出峰(254.2) 來自于受試樣品在質(zhì)譜條件下解離成酮咯酸的出峰信號；負離子模式下的質(zhì)譜出峰(509.4) 來自于受試樣品在質(zhì)譜條件下解離成酮咯酸二倍體的出峰信號。以上分析結(jié)果與受試樣品—— 酮咯酸鈣的相對分子質(zhì)量與分子式一致。

2.1.5 核磁共振(NMR) 分析

將適量受試樣品溶解于DMSO-d6 約0.5 ml 中，進行如下NMR 檢測：1H NMR、13C NMR、COSY、HSQC、HMBC 分析。樣品的核磁共振1H NMR、13C NMR 譜圖見圖6，NMR 譜圖信息顯示樣品結(jié)構(gòu)與酮咯酸鈣結(jié)構(gòu)信息相符。

2.2 微粒的結(jié)構(gòu)分析

綜合上述檢測結(jié)果， 推斷1 注射液中可見微粒的生成與鈣有明顯關(guān)系，推斷該物質(zhì)可能為酮咯酸鈣，相對分子質(zhì)量為548.61，分子式為C30H24CaN2O6，其結(jié)構(gòu)式如圖7 所示。

2.3 酮咯酸鈣的來源分析

通過分析注射劑生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵工藝控制點，推測酮咯酸鈣的生成可能與注射液所用包裝系統(tǒng)有關(guān)。目前上市的1 注射液包裝系統(tǒng)多為玻璃安瓿或玻璃管制注射劑瓶，經(jīng)研究表明，1 注射液在長期貯存過程中，玻璃瓶( 玻璃安瓿及玻璃注射劑瓶) 中的鈣會不斷遷移出來，與注射液中的酮咯酸不斷結(jié)合，從而形成酮咯酸鈣微粒。

2.4 微?？刂品椒ㄑ芯?/span>

為避免此類現(xiàn)象的發(fā)生，本研究分別對玻璃瓶與PP 安瓿中的鈣含量進行對比研究，選用不同編號的玻璃安瓿與PP 安瓿，分別用pH 2.0 鹽酸提取液( 量取濃鹽酸0.9 ml，用水稀釋至1 000 ml) 和pH 12.0 氫氧化鈉提取液( 稱取氫氧化鈉0.4 g，用水稀釋至1 000 ml) 經(jīng)不同的方式處理( 見表4，所列均為扣除不加任何鈣元素的空白后的數(shù)據(jù))，測定鈣含量。結(jié)果顯示，玻璃安瓿中遷移出來的鈣含量遠高于PP 安瓿。因此為抑制酮咯酸鈣的形成，包材應選擇鈣含量低的PP 安瓿。

2.5 兔血管刺激性試驗

對本公司生產(chǎn)的1 注射液( 批號F1903021-1，包材材質(zhì)為PP 安瓿，注射液中無顆粒物) 和廠家A( 批號93090DK，包材材質(zhì)為玻璃瓶，注射液中有顆粒物) 生產(chǎn)的1 注射液進行兔血管刺激性試驗，采用同體左右側(cè)自身對照方法，耳緣靜脈推注給藥，給藥頻率為每日2 次，共給藥5 日。結(jié)果見圖8，

3、討論

經(jīng)異物檢查和數(shù)據(jù)推斷，注射液中的微粒可認為是藥液中的酮咯酸與玻璃瓶中遷移出來的鈣反應生成的酮咯酸鈣，由于酮咯酸鈣的生物活性未知，并不能排除其對人體造成的影響。但此類異物的存在，對注射液使用時的安全性造成了一定影響，故應在藥物生產(chǎn)和使用過程中給予重視，若在臨床使用時發(fā)現(xiàn)可見異物，應立即停止使用。此外，應用先進的儀器分析技術(shù)對可見異物進行結(jié)構(gòu)和定性分析，具有一定的科學性、可行性和有效性。