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洋蔥伯克霍爾德菌群（Burkholderia cepaciacomplex，BCC）是一組表型相似、基因型不同的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于土壤和水中，可引起囊性纖維化、慢性肉芽腫患者或低免疫力易感人群的嚴(yán)重感染，甚至危害生命，對公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重危害。BCC 污染導(dǎo)致的醫(yī)院爆發(fā)性感染事件和藥品召回案例頻發(fā)，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布的2004—2011年因微生物污染召回事件中，BCC污染占比達(dá) 34%［1］。FDA 將 BCC 歸為不可接受的微生物，并明確要求非無菌水性基質(zhì)藥品關(guān)注BCC的檢查和控制［2］。2021 年 9 月 FDA 發(fā)布了《非無菌藥品生產(chǎn)中的微生物質(zhì)量考量》行業(yè)指南草案［3］，闡述了非無菌水性基質(zhì)藥品受BCC污染的風(fēng)險及控制，同時明確參照美國藥典（USP）<60>進(jìn)行BCC的檢測。

2021年11月國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布的《化學(xué)藥品創(chuàng)新藥上市申請前會議藥學(xué)共性問題相關(guān)技術(shù)要求》明確要求對于吸入、口服、黏膜、皮膚和鼻腔給藥的水溶液非無菌制劑，一般應(yīng)參照相關(guān)技術(shù)要求對洋蔥伯克霍爾德菌進(jìn)行研究，并制定相應(yīng)的控制策略［4］。歐盟和日本藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)尚未對 BCC 的控制提出監(jiān)管意見。結(jié)合筆者近幾年對于非無菌水性基質(zhì)藥品審評中發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)研究者對于BCC認(rèn)識尚處于起步階段，少有研究者主動基于產(chǎn)品風(fēng)險開展必要的控制菌篩查和探索，已提交的非無菌水性基質(zhì)藥品上市申請中普遍存在BCC研究不充分的問題。

BCC 在營養(yǎng)有限的水性環(huán)境中有較強(qiáng)的生存能力，且對治療用抗菌藥和抑菌劑有廣泛的耐藥性，非無菌水性基質(zhì)藥品中存在BCC的潛在風(fēng)險較高［3］，因此建立 BCC預(yù)防及控制策略對藥品安全至關(guān)重要。本文對BCC的特性、檢測及風(fēng)險評估和控制策略進(jìn)行闡述，為非無菌水性基質(zhì)藥品中BCC的研究和控制提供參考。

1BCC的特性

洋蔥伯克霍爾德菌最早由美國植物病理學(xué)家Walter H. Burkholder 首次從洋蔥根部分離發(fā)現(xiàn)，因引起洋蔥根莖腐爛而得名。依據(jù) 16S-rRNA基因測序等技術(shù)，BCC 被分為表型相似基因型不同的 9 個基 因 型 ：B. cepacia genomovar I、B. cepaciagenomovarⅡ（B. multivorans）、B. cepacia genomovarⅢ（B. cenocepacia）、B. cepacia genomovar Ⅳ（B.stabilis）、B. cepacia genomovar V（B. vietnamiensis）、B. cepacia genomovar Ⅵ（B. dolosa）、B. cepaciagenomovar Ⅶ（B. ambifaria）、B. cepacia genomovarⅧ（B. anthina）、B. cepacia genomovar Ⅸ（B.pyrrocinia），其 中 洋 蔥 伯 克 霍 爾 德 菌（B. cepaciagenomovar I）是 自 然 界 分 離 獲 得 最 常 見 的 菌 株之一［5］。

BCC是一類在土壤、水中普遍存在的革蘭陰性桿菌，是引起感染的條件致病菌，可造成免疫力低下的易感人群或囊性纖維化和慢性肉芽腫患者嚴(yán)重感染，約1/3的BCC感染患者最終發(fā)展為敗血癥，同時 BCC 污染引發(fā)的包括重癥監(jiān)護(hù)室、血液透析室、內(nèi)窺鏡檢查室等醫(yī)院感染事件頻發(fā)［6-10］。BCC具有多重固有的抗菌藥物耐藥性，耐藥機(jī)制包括降低外膜通透性、誘導(dǎo)產(chǎn)生 β 內(nèi)酰胺酶和外排泵作用等［11］，對臨床常用的 β-內(nèi)酰胺類、多黏菌素、以及氨基糖苷類抗菌藥物都有一定耐藥性，這導(dǎo)致BCC感染后抗菌藥物選擇受到限制，治療難度大；同時，也提示不能忽視抗菌藥品被BCC污染的風(fēng)險。

BCC 在低營養(yǎng)條件水性環(huán)境下仍能長時間存活，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。BCC還被證實(shí)對藥品中常用的抑菌劑，如尼泊金酯類（羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯）、季銨鹽類（苯扎氯銨、苯扎溴銨）有一定耐受性。FDA發(fā)布的 2009—2013年因 BCC污染召回的產(chǎn)品中大部分含有抑菌劑［3］，同時 FDA國家毒理學(xué)研究中心 2016—2017 年度報(bào)告中明確指出BCC對苯扎氯銨具有降解能力和耐藥性［12］，BCC可利用自身的外排系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)降低苯扎氯銨的抑菌作用［13］。沈海英等［14-15］發(fā)現(xiàn)在含有尼泊金類抑菌劑的抗真菌乳膏中和含有對羥苯甲酯、羥苯乙酯的凝膠劑中均檢出BCC。

2BCC的檢測

2019 年美國藥典（USP）發(fā)布了關(guān)于非無菌藥品 中 BCC 檢 查 的 通 則 <60> Microbiologicalexamination of nonsterile products—tests forBurkholderia cepacia complex［16］，用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下檢查產(chǎn)品中是否存在BCC，尤其適用于吸入劑或用于口服、口腔黏膜、皮膚和鼻腔的非無菌水溶液劑。USP通則<60>對BCC檢查的菌株、培養(yǎng)基適用性檢查（包括促生長能力、抑制能力及指示特性檢查）、方法適用性試驗(yàn)、供試品檢查方法以及培養(yǎng)基的制備等方面作了較詳細(xì)的規(guī)定。需要注意該檢測方法應(yīng)采用 B. cepacia、B. cenocepacia 或 B.multivorans 菌株進(jìn)行培養(yǎng)基促生長能力檢查、采用銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌開展抑制能力檢查 ，培 養(yǎng) 基 為 洋 蔥 伯 克 霍 爾 德 菌 選 擇 性 瓊脂（BCSA），BCSA 培養(yǎng)基含有多黏菌素 B、萬古霉素及慶大霉素，用以消除其他控制菌的生長干擾。方法適用性試驗(yàn)和供試品檢查中出現(xiàn)的菌落形態(tài)特征觀察和鑒定：BCC的指示特征為周圍黃色的綠棕色菌落或者周圍粉紅色的白色菌落。若 BCC 檢驗(yàn)程序或供試品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時，應(yīng)重新開展方法適用性試驗(yàn)；對于有抑菌作用的供試品（ 包 括 含 抑 菌 劑 產(chǎn) 品 ），應(yīng) 參 照 USP<61>Microbiological examination of nonsterile products：Microbial enumeration tests消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)［17］。

《中國藥典》（ChP）2020 年版未收載 BCC 檢查的技術(shù)要求，考慮該菌群潛在的風(fēng)險，藥典委協(xié)同相關(guān)部門正在推進(jìn) BCC 檢查和技術(shù)要求制定工作［15］?，F(xiàn)階段，國內(nèi)企業(yè)和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)可參考 USP<60>開展非無菌水性基質(zhì)藥品、原輔料、制藥用水中的 BCC 檢測；由于 BCC 具有較強(qiáng)環(huán)境適用性并有多種表型，需要關(guān)注方法的適用性及菌落的鑒定、分類。

3BCC控制的考慮要點(diǎn)

3.1 BCC與水分活度

水分活度（water activity，aw）是產(chǎn)品中水分的能量狀態(tài)的表征，可作為微生物風(fēng)險控制的關(guān)鍵參數(shù)，比水分含量更有意義［18］。2018年USP增加了關(guān)于 aw的通則<922>water activity，用于指導(dǎo) aw值的測定和應(yīng)用。aw指在相同溫度下，產(chǎn)品中的水蒸氣壓與純水蒸氣壓之比［19］，數(shù)值介于 0～1。aw可用于快速有效評估微生物的繁殖能力，在高 aw值條件下，微生物生長良好；在低 aw值條件下，微生物生長則受 到 抑 制 ，微 生 物 低 于 最 低 生 長 aw 值 將 不 能繁殖［20］。

USP<1112>Application of water activitydetermination to nonsterile pharmaceutical products，對 aw在非無菌藥品中微生物控制的應(yīng)用提供了指導(dǎo)，收載了微生物生長需要的 aw參考值。革蘭陰性菌如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和沙門氏菌在 aw＜0.91 的產(chǎn)品中不易增殖，而革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌等在 aw＜0.86 時不易增殖 ，黑曲霉在 aw＜0.77 時不易增殖，aw＜0.60 時所有微生物均不會增值［21］。文獻(xiàn)報(bào)道BCC生長所需最低的aw為0.95［22］，不同劑型和處方中BCC最低生長aw值略有差異，研究報(bào)道某凝膠劑中 BCC 最低生長 aw值為 0.97，與BCC 生長所需最低 aw值接近，表明該凝膠劑中的BCC 有進(jìn)一步繁殖的可能。另有研究報(bào)道在以氯化鈉為調(diào)節(jié)介質(zhì)的液體制劑中 BCC 生長所需的最低aw值約為0.98，同時還發(fā)現(xiàn)aw值與BCC生長速率密切相關(guān)，BCC 在高 aw值的液體制劑中生長良好，而在低 aw 值的液體制劑中 BCC 的生長則受到抑制［15，23-24］。因此，在非無菌水性基質(zhì)藥品早期處方開發(fā)和篩選階段，可結(jié)合 aw值考察不同處方組成與aw的相關(guān)性，并通過調(diào)整可影響 aw值的介質(zhì)（氯化鈉、葡萄糖、乙醇、丙醇、甘油）濃度，優(yōu)化制劑 aw值以降低BCC潛在的繁殖風(fēng)險［21］。

3.2 BCC與抑菌劑抑菌濃度

BCC 對非無菌水性基質(zhì)藥品中使用的一些抑菌劑具有耐藥性，應(yīng)關(guān)注相關(guān)抑菌劑對BCC的抑菌效力，必要時應(yīng)增加BCC菌種作為抑菌效力評估試驗(yàn)測試菌株。抑菌劑用量低于最低抑菌濃度則BCC有進(jìn)一步繁殖的可能，反之可降低BCC對抑菌劑耐受的潛在風(fēng)險。有研究報(bào)道苯扎氯銨、苯扎溴銨、羥苯甲酯、羥苯乙酯對洋蔥伯克霍爾德菌的最低抑菌濃度分別為 32、64、512、2 048 μg·mL−1［15］，Kim 等［25］發(fā)現(xiàn)苯扎氯銨對洋蔥伯克霍爾德菌的最低抑菌濃度為50 µg·mL−1。

3.3 風(fēng)險評估及控制

水性液體制劑、半固體制劑（懸浮液、洗劑、乳膏、軟膏）比固體制劑具有更高的水分活度，水性基質(zhì)的非無菌藥品被 BCC 污染的風(fēng)險較高。鑒于BCC具有抑菌劑耐藥性，即使含有抑菌劑的非無菌藥品 ，仍有可能在使用時存在不安全水平。ChP2020年版四部通則1107《非無菌藥物微生物限度標(biāo)準(zhǔn)》中明確要求根據(jù)原輔料及其制劑的特性和用途、制劑生產(chǎn)工藝等因素，對其他可能存在的具有潛在危害的微生物進(jìn)行檢查［26］。因此，產(chǎn)品生產(chǎn)過程、貨架期甚至使用時（尤其是多劑量包裝產(chǎn)品）都應(yīng)基于風(fēng)險識別、分析和評價，建立 BCC 控制措施和程序。

《非無菌藥品生產(chǎn)中的微生物質(zhì)量考量》指出生產(chǎn)過程所使用的制藥用水和天然組分是 BCC 最有可能的來源，并明確為確保產(chǎn)品質(zhì)量和患者用藥安全，非無菌水性藥品生產(chǎn)中應(yīng)執(zhí)行完善的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（cGMP）管理，包括建立基于 BCC風(fēng)險管理的設(shè)計(jì)和控制、穩(wěn)健的水系統(tǒng)管理、恰當(dāng)?shù)纳a(chǎn)組分微生物負(fù)荷、經(jīng)清潔和消毒的設(shè)備、經(jīng)驗(yàn)證的BCC過程控制和成品檢查規(guī)程等［3］。

研究者可結(jié)合產(chǎn)品特有要素（劑型、水分活度、產(chǎn)品用途、包裝、產(chǎn)品組成和比例等）和生產(chǎn)要素（生產(chǎn)過程、制水系統(tǒng)、生產(chǎn)環(huán)境、過程控制等）進(jìn)行全面的 BCC風(fēng)險評估，對 BCC進(jìn)行研究和檢查，制定合理的控制策略［3］。從源頭、過程控制上降低或避免BCC污染風(fēng)險，建立有針對性的檢查和控制方案，建立制藥用水和制劑中BCC的控制策略。目前，ChP 尚未制定 BCC 的檢查方法，研究者在菌種選擇、檢查方法及驗(yàn)證方面均可能存在困難。在ChP 公布法定方法之前，建議研究者對代表商業(yè)化生產(chǎn)批樣品進(jìn)行風(fēng)險評估和檢測分析，結(jié)合評估結(jié)果將 BCC 檢查方法訂入產(chǎn)品的放行標(biāo)準(zhǔn)。待國內(nèi)法定方法公布后，建議結(jié)合研究情況將BCC作為控制菌的常規(guī)檢查方法，訂入藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)，研究者可以根據(jù)產(chǎn)品批次數(shù)據(jù)的積累，參考ICH Q6A微生物限度決策樹的要求，適時調(diào)整BCC的控制策略。

4結(jié)語

非無菌水性基質(zhì)藥品中不可接受微生物-BCC污染存在較高的風(fēng)險，應(yīng)引起國內(nèi)制藥行業(yè)的關(guān)注。研究者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特有要素、生產(chǎn)要素，開展非無菌水性基質(zhì)藥品中BCC污染的風(fēng)險評估，制定全面有效的控制策略，建立經(jīng)驗(yàn)證的控制菌檢查方法，進(jìn)行制藥用水和制劑中 BCC 的分析和控制，確保非無菌水性基質(zhì)藥品微生物質(zhì)量，保障公眾用藥安全。