中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

質(zhì)譜技術(shù)是抗體藥物分析最重要的技術(shù)手段之一。本文簡述了抗體藥物的發(fā)展和質(zhì)譜技術(shù)的原理。對于質(zhì)譜技術(shù)在抗體藥物的分析中應(yīng)用進行了歸類整理，主要分為在一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用。

抗體類藥物是指含有抗體片段的蛋白類藥物，所以在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的發(fā)展，是當(dāng)前生物藥物領(lǐng)域增長最快的一類藥物。

01  抗體藥物發(fā)展新趨勢

在生物藥物領(lǐng)域，抗體藥物占據(jù)著越來越重要的地位，全球銷售排名前10位的藥物中有6個為抗體藥物，抗體藥物按來源分類可以分為：鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。目前，批準的單克隆抗體藥物中，人源化單抗和全人源單抗數(shù)量已占據(jù)大多數(shù)。

（1）抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）

抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）由單克隆抗體和小分子化合物兩部分組成。通過抗體的靶向作用，ADC 的抗體部分和腫瘤細胞表面抗原特異性識別并結(jié)合，通過細胞內(nèi)吞作用，將抗體和小分子化合物一起帶進腫瘤細胞內(nèi)部，釋放出小分子化合物。這樣既可以降低小分子藥物的毒性，同時具有靶向結(jié)合的作用。已經(jīng)上市的兩個ADC 是Kadyla 和Adcetris。

（2）雙特異性抗體（BsAb）

雙特異性抗體（BsAb）是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，由于基因工程的發(fā)展，目前雙特異性抗體已經(jīng)研發(fā)出多種類型，主要類型有三功能雙特異性抗體、IgG-scFv、三價雙特異性分子、串聯(lián)單鏈抗體（串聯(lián)scFv）、DVD-Ig 等多種形式。

蛋白質(zhì)多肽藥物，是一些分子量從幾千Da到十幾萬Da的生物大分子。與傳統(tǒng)的化藥分子相比，生物藥分子有著非常復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)，這些高級結(jié)構(gòu)直接和生物藥分子的功能相關(guān)。基于HDX技術(shù)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并不是一個新的研究領(lǐng)域，該技術(shù)理念早就上20世紀50年代就已提出。目前HDX-MS技術(shù)儼然已成為生物化學(xué)家探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、動力學(xué)和功能的重要工具之一。檢測骨架氫轉(zhuǎn)換率最早的方法是用氚代和濃度梯度柱，直到80~90年代期間才逐漸被氘代和核磁共振（NMR）技術(shù)替代。由于HDX-MS在進樣和數(shù)據(jù)分析方面更加自動化，該技術(shù)逐漸成為研究蛋白質(zhì)生物藥領(lǐng)域中的新寵，尤其是在抗原表位分析和質(zhì)量控制方面。

圖1 生物藥分子的高級結(jié)構(gòu)

圖2 不同生物藥制劑的高級結(jié)構(gòu)對比

02  高級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)、核酸類分子的高級結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，早在上個世紀50年代，就為人類認識生命的奧秘做出了重大的貢獻。發(fā)展到今天，生物醫(yī)藥領(lǐng)域可以使用為數(shù)眾多的現(xiàn)代分析技術(shù)，對生物藥的高級結(jié)構(gòu)進行各種層次的分析：X-ray 衍射、核磁共振、冷凍電鏡、HDX、CD 和 FTIR 等。

03  實驗原理

HDX（氫氘交換）是一項廣泛的應(yīng)用在溶液狀態(tài)中蛋白質(zhì)多肽分子結(jié)構(gòu)的技術(shù)。其主要原理是，在溶液中蛋白質(zhì)分子骨架的氫原子和溶液中的氘的交換。在表面的骨架氫原子和氫鍵作用力弱的氫，交換的速度快；在內(nèi)部結(jié)構(gòu)的骨架氫和氫鍵作用力強的氫原子，交換速率慢。使用質(zhì)譜儀，對氘代后的蛋白質(zhì)分子進行分析，可以獲得氘代的比例和位置信息。

圖3 氫氘交換過程

EXPERT OPINION ON DRUG DISCOVERY, 2017 VOL. 12, NO. 10, 981-994

04  實驗步驟

APT推出的HDX服務(wù)基本實驗步驟如下：

蛋白質(zhì)藥物置于中性溶液，非變性條件下 ? 加入抗原等結(jié)合分子（可選） ?  加入氘代緩沖液 ? 氘代若干時間點 ? 終止反應(yīng) ? 在線酶解（pepsin） ? LCMSMS分析 ? 軟件處理數(shù)據(jù) ? 數(shù)據(jù)作圖 ? 正式報告

圖4 HDX的基本實驗流程

05  高級結(jié)構(gòu)的批次對比

HDX分析技術(shù)，在生物藥質(zhì)量研究中的多個領(lǐng)域都有應(yīng)用，其中生物藥生產(chǎn)中批次對比（或者生物仿制藥的原研對比）是較為直接的一種。通過對不同批次或者不同生產(chǎn)廠商的相同序列生物藥大分子的HDX分析，對數(shù)據(jù)進行軟件解析后，能夠獲得氨基酸序列級別的分析能力。圖4是一個多批次的單抗樣品的HDX比對圖（蝴蝶圖），從圖中可以獲得關(guān)于按照序列分析的氨基酸殘基位點的氘代交換程度。

圖5 HDX批次分析

06  抗原表位分析

中科新生命提供的HDX分析服務(wù)，使用高分辨質(zhì)譜（QE）采集數(shù)據(jù)?？梢栽诘鞍踪|(zhì)樣品預(yù)處理時，加入抗原，后續(xù)進行抗原表位析，確定抗原抗體結(jié)合位點。在這類數(shù)據(jù)分析中，解析的是抗原分子的氘代程度，而非抗體?？乖砦环治鰧τ谏锼幍那捌陂_發(fā)非常重要。

圖6  抗原表位分析（HDX）

除了上述數(shù)據(jù)，HDX分析數(shù)據(jù)的展示還有多重形式。圖7是氘代程度的統(tǒng)計學(xué)分析（必須至少重復(fù)三次）；圖8 是氘代后的肽段覆蓋率數(shù)據(jù)展示。