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嘉峪檢測網(wǎng) 2022-11-03 02:49
近40 年來，親和層析 (AC) 已被廣泛用于大規(guī)模生物工藝，被認(rèn)為是各種類型生物藥下游工藝中初步捕獲的首選方法。本文的目的是介紹a) 生物工藝親和層析的歷史，b) 基于親和捕獲步驟的平臺工藝的現(xiàn)狀，c) 定制開發(fā)生物工藝親和填料的成熟領(lǐng)域，d)與其它形式的層析方法相比，基于親和捕獲的下游工藝的優(yōu)勢，以及e) 生物工藝親和層析的未來方向。通過使工藝開發(fā)和生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)化以及在靈活的多產(chǎn)品生產(chǎn)設(shè)施中使用連續(xù)操作，親和層析的使用可以帶來多方面的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。這些概念將基于日益增長的定制親和生物工藝填料領(lǐng)域進(jìn)行討論。定制親和填料不僅滿足了非平臺化工藝對捕獲填料的需求，而且還可用于精純應(yīng)用，通過將特定產(chǎn)品異構(gòu)體與所需產(chǎn)品形式分離來定義和控制藥物底物組成。
在下文中，我們將從生物工藝的角度進(jìn)一步討論AC的優(yōu)勢。主題包括：工藝經(jīng)濟(jì)性和工藝穩(wěn)健性、平臺設(shè)施概念、工藝開發(fā)和工藝設(shè)計以及集成式連續(xù)運行。
Part1 工藝經(jīng)濟(jì)性
毫無疑問，親和填料比傳統(tǒng)填料（如離子交換或疏水相互作用層析填料）更昂貴。它們每升的價格要高出三到十倍，因為i) 與生產(chǎn)其它類型的配基相比，用于生物工藝應(yīng)用的親和配基的生產(chǎn)更加復(fù)雜，因此成本更高，并且ii) 從公司運營的角度看，填料價格體現(xiàn)了AC提供的經(jīng)濟(jì)利益，包括減少工藝開發(fā)時間以及更高收率的生產(chǎn)操作。
從生產(chǎn)工藝的角度來看，確定填料成本的常用方法是計算每克純化目標(biāo)產(chǎn)品的成本。該成本與填料可以使用的循環(huán)次數(shù)和有效結(jié)合載量（上樣 ×步驟收率）成反比，并與填料和緩沖液成本成正比。由于AC 填料的成本很高，它對商品總成本的影響可能很大，例如，對于特定的純化工藝，Protein A可能占到商品總成本的 60%。但是，相比關(guān)注AC對純化工藝總體商品成本的相對成本，如果分析的重點是實際生產(chǎn)成本，那么可以表明，在下游工藝中使用AC 通常會降低商品的總成本。AC 減少了純化步驟的數(shù)量，從而提高了整體工藝收率并縮短了工藝時間。圖 1 舉例說明了這一點，該圖顯示了非親和（四步）和基于親和（三步）純化工藝的COG 分析比較，它們都產(chǎn)生相同純度的藥物底物（在兩個工藝中，最后兩個層析步驟相同）。與非親和工藝相比，將AC 作為第一步的三步工藝可以將產(chǎn)品的總成本降低1.5 倍，即使前兩個非親和步驟具有更高的上樣載量。由于與AC 步驟相比，第一個非親和步驟具有低得多的步驟收率，因此與單個AC 步驟相比，兩個非親和步驟之后的整體工藝收率顯著降低(30%)。總收率越低，生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量越低，即使非親和工藝的耗材成本與基于親和工藝的情況相比要低得多，這也會推動COG 上升。其他研究人員也報道了類似的結(jié)果。顯然，只有在可使整體工藝收率大幅增加時，才應(yīng)考慮用AC 步驟替換多個非特異性步驟。
圖1.基于親和和非親和捕獲步驟的 DSP 工藝（工藝 I和 II）之間的 COG 分析比較結(jié)果示例。圖：A)兩個工藝的簡化工藝布局（相關(guān)的動態(tài)結(jié)合載量，DBC，在各自的框中給出，兩個工藝的所有其它步驟相同）；B) 過程 I（空心符號）和過程 II（實心符號）中每個下游加工步驟后的累積過程產(chǎn)量（三角形）和純度（圓圈）；C) 以過程 II 值的百分比變化表示的典型過程經(jīng)濟(jì)指標(biāo)的變化。
通過增加填料循環(huán)和改善目標(biāo)上樣，可以進(jìn)一步降低AC 的 COG。相對于前者，當(dāng)一種填料被使用 33 倍時，其每升價格有效降低到低于一平方米一次性除病毒過濾器的成本（例如，Protein A：$15k/L，上樣30 g/L，33 個循環(huán) → $15/g；Planova 15N：$5k/m2，50 L/m2，5 g/L → $20/g）。更多的填料循環(huán)可進(jìn)一步降低填料成本，使填料壽命成為重要的工藝優(yōu)化參數(shù)。例如，Protein A 填料現(xiàn)在常規(guī)循環(huán) 100-200 次，從而提高了工藝經(jīng)濟(jì)效益。結(jié)合更多的目標(biāo)蛋白也將降低每克純化目標(biāo)產(chǎn)品的表觀填料成本。例如，這可以通過增加上樣保留時間，或K. ??cki 和 H. Johansson 在舊金山PREP 2003 會議上提出的流速編程方法來實現(xiàn)，此外，也可以通過定期逆流操作。為基于Protein A 的捕獲步驟開發(fā)的工藝優(yōu)化原則不受手頭親和填料類型的影響，可用于其它工藝。
雖然降低 COG 應(yīng)該是工藝開發(fā)的目標(biāo)，但需要記住的是，高度優(yōu)化的工藝必須是穩(wěn)健的；因為即使是單個失敗的批次也可能代價高昂，以至于通過工藝優(yōu)化實現(xiàn)的任何節(jié)省都可能會丟失。從工藝穩(wěn)定性的角度來看，親和層析（AC）可能被證明是比其它層析方法更好的捕獲步驟選擇，因為它依賴于目標(biāo)產(chǎn)物和配基之間非常特異性的相互作用。這種相互作用對進(jìn)樣液流組成的變化通常不如目標(biāo)產(chǎn)物與離子交換、混合模式或疏水相互作用填料之間的相互作用那么敏感。使用這些填料，可能會發(fā)生與非特異性相互作用和不同組分濃度相關(guān)的置換現(xiàn)象，這反過來可能會影響藥物底物純度和/或工藝收率。此外，與傳統(tǒng)層析填料相比，AC 步驟往往具有更寬的操作范圍。這種更寬的設(shè)計空間提高了工藝的穩(wěn)健性，并最大限度地減少了產(chǎn)品調(diào)查和批次失敗，從而改善COG。
最后，從公司工藝組合的角度來看，使用AC 可以帶來額外的財務(wù)收益，這些收益與減少工藝開發(fā)、規(guī)模放大和技術(shù)轉(zhuǎn)移所需的FTE數(shù)量相關(guān)。對于單個項目，這些收益在產(chǎn)品開發(fā)的各個階段可能總計達(dá)數(shù)百萬美元。
Part2 下游工藝的標(biāo)準(zhǔn)化
親和層析允許產(chǎn)品開發(fā)的各個階段標(biāo)準(zhǔn)化，從研究活動（例如克隆篩選）到簡化的工藝開發(fā)，包括更容易的技術(shù)轉(zhuǎn)移，直到中試和大規(guī)模生產(chǎn)。對于生產(chǎn)操作，當(dāng)使用相同類型的親和填料作為同一分子家族中多個目標(biāo)產(chǎn)品的捕獲步驟時，例如MAb 或 AAV，整個下游工藝可稱為平臺化工藝。生物工藝界在 2000 年代初采用了這個術(shù)語，因為它非常“優(yōu)雅”地抓住了整個行業(yè)的趨勢，即Protein A 被用作純化當(dāng)時生產(chǎn)或正在開發(fā)的所有 MAb 的捕獲步驟。除了標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)操作之外，平臺工藝概念在加速工藝開發(fā)、規(guī)模放大和技術(shù)轉(zhuǎn)移以及定義生產(chǎn)設(shè)施布局方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
1 平臺工藝
平臺工藝由高選擇性的、基于 AC 的捕獲步驟組成，隨后是幾個精純步驟以達(dá)到最終純度。通常，每家公司都會開發(fā)一些平臺工藝的變體，這些變體在捕獲步驟后的單元操作順序上有所不同，以確保無論目標(biāo)分子異構(gòu)體或手頭的純化挑戰(zhàn)如何，其都能處理所有類型的雜質(zhì)，無論是工藝還是產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)。
迄今為止，只有少數(shù)幾類治療性分子存在純化平臺，例如MAb、一些抗體片段和病毒。對于其它類型的分子，在其結(jié)構(gòu)中已經(jīng)具有、或可以經(jīng)工程設(shè)計后具有保守基序，公司可以考慮引入基于針對保守基序開發(fā)的定制親和填料的內(nèi)部下游工藝平臺，這將使公司能夠快速將多種候選藥物推進(jìn)至臨床開發(fā)。這樣的純化平臺可以而且通常是公司獨有的，它將在競爭已經(jīng)非常激烈的生物工藝領(lǐng)域提供額外的競爭優(yōu)勢。
2 工藝開發(fā)
基于非親和的初步捕獲步驟的主要缺點之一是，對于待開發(fā)的每個新分子，必須將大量的工藝開發(fā)工作應(yīng)用于所有單元操作。為了減少開發(fā)工作和時間，理想的解決方案是使用現(xiàn)有的親和捕獲填料，該填料要么對廣泛的類似分子通用，要么，如果不存在這種填料，則可以快速開發(fā)而不會影響整個工藝開發(fā)時間線。事實上，可以說使用親和層析縮短了時間并降低了工藝開發(fā)的成本，因為可以開發(fā)出非常穩(wěn)健的下游純化工藝，并以較少的FTE 進(jìn)行規(guī)模放大。例如，與重組蛋白工藝開發(fā)相關(guān)的FTE 總數(shù)可能高達(dá) 36 FTE，總成本達(dá)數(shù)百萬美元，因此，即使工藝開發(fā)所需的 FTE 數(shù)量少量減少，也可大幅降低工藝開發(fā)成本。然而，與縮短工藝設(shè)計活動時間相關(guān)的最大收益是由于縮短了上市時間。據(jù)報道，每縮短上市時間一天的稅后凈回報凈現(xiàn)值甚至可能價值約50 萬美元。
Part3 平臺下游工藝車間
親和層析可以標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)設(shè)施。通過下游工藝車間的“平臺化”，可以將單一產(chǎn)品設(shè)施（例如MAb）“轉(zhuǎn)化”為多產(chǎn)品設(shè)施。該車間將被設(shè)計（例如，專用的系統(tǒng)和罐數(shù)量）以適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)純化工藝，其將包括細(xì)胞去除步驟，然后是結(jié)合-洗脫親和層析捕獲步驟，然后是一個或兩個精純層析步驟，除病毒過濾以及 UF /DF 步驟。
由于每種產(chǎn)品類型的捕獲步驟將根據(jù)由清洗、平衡、上樣、漂洗、洗脫和淋洗階段組成的相同方案進(jìn)行操作，因此將實現(xiàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化將導(dǎo)致設(shè)施簡化，并可能實現(xiàn)生產(chǎn)過程的自動化。此外，由于所有輔助設(shè)備和文檔也是相似的，因此這種平臺化的DSP 車間將提高工藝穩(wěn)健性、運營效率以及設(shè)施利用率，從而降低COG。
1 連續(xù)操作
與親和層析相關(guān)的另一個優(yōu)勢是，由于工藝和設(shè)施的標(biāo)準(zhǔn)化，它能夠幫助實現(xiàn)連續(xù)和強(qiáng)化工藝。越來越多的工藝正在開發(fā)，其中上游以灌流模式運行，或以N-1 強(qiáng)化批次工藝，并將澄清的細(xì)胞培養(yǎng)液(CCCF) 直接（連續(xù)）上樣到捕獲柱上。然而，CCCF組成的潛在變化可能導(dǎo)致捕獲柱洗脫池的組成差異性。洗脫液組成的這些變化將對捕獲步驟下游的單元操作造成挑戰(zhàn)。因此，捕獲洗脫池具有可比性是有益的，而不管上游可能在較長的灌流運行中或在補(bǔ)料分批工藝中產(chǎn)生變化。從上述觀點來看，基于親和的捕獲步驟將充當(dāng)工藝控制節(jié)點，在捕獲步驟之后獲得標(biāo)準(zhǔn)化工藝液流?？梢杂^察到這種標(biāo)準(zhǔn)化，因為只要捕獲柱上樣至相同的目標(biāo)值，進(jìn)樣組成的變化就會得到緩解，因為捕獲步驟的洗脫池將具有相同的組成和濃度。從而，純化工藝中的其余步驟將被標(biāo)準(zhǔn)化，這反過來將提高整體下游工藝的穩(wěn)健性。
2 精純應(yīng)用
在生物工藝應(yīng)用中使用親和填料不僅限于捕獲步驟。親和填料也可以考慮用于精純應(yīng)用，例如當(dāng)以流穿模式使用時去除工藝相關(guān)雜質(zhì)，或者它們可用于將目標(biāo)分子的所需形式與密切相關(guān)的產(chǎn)品雜質(zhì)分離，例如，選擇性洗脫。前一種應(yīng)用的例子可以是去除內(nèi)毒素，而后者的例子可以是使用Regeneron 描述的Protein A 親和層析純化雙特異性抗體。Regeneron 雙特異性抗體形式基于兩條重鏈在相同的細(xì)胞培養(yǎng)中共表達(dá)，導(dǎo)致兩種親本IgG 雜質(zhì)的形成。然而，由于其中一條重鏈通過Fc 部分中的二肽取代進(jìn)行了修飾，這消除了Protein A 的結(jié)合，因此，通過使用裝填了高分辨填料的層析柱，可基于Protein A 填料從未取代的親本 IgG 中純化雙特異性抗體，即利用了結(jié)合的雙特異性和親本非取代 IgG 在選擇性洗脫過程中的親和性差異。后來使用不同的Protein A 填料開發(fā)了這種純化工藝的新版本，通過利用其它Protein A 配基結(jié)合特性的差異，實現(xiàn)了單親和步驟純化。
Part4 生物工藝親和層析領(lǐng)域的未來狀態(tài)
Protein A 填料的開發(fā)歷史表明，隨著時間的推移，填料載量和堿穩(wěn)定性得到了顯著改善。尤其是堿穩(wěn)定性（0.1 m NaOH）的改善，其首先是基于Protein-A B-結(jié)構(gòu)域修飾的Protein A 配基 (MabSelect SuRe) 于2013年上市而實現(xiàn)的，標(biāo)志著生物工藝Protein A填料市場新紀(jì)元的開始。從那時起，行業(yè)已經(jīng)引入了多種基于Protein A C 結(jié)構(gòu)域修飾版本的新配基。這些產(chǎn)品提供類似于原始 MabSelect SuRe 配基的堿穩(wěn)定性。最近，Protein A B-結(jié)構(gòu)域的進(jìn)一步開發(fā)獲得了比 MabSelect SuRe 更穩(wěn)定的配基（高達(dá)0.5 m NaOH）。在更嚴(yán)苛的條件下清潔這些填料的能力可以更好地控制生物負(fù)載并延長填料的使用壽命。
毫無疑問，對于為 MAb 以外的靶點開發(fā)的親和填料，填料載量和穩(wěn)定性同樣重要。然而，可以預(yù)期，開發(fā)具有更高化學(xué)穩(wěn)定性的填料比開發(fā)具有更高載量的填料更容易。穩(wěn)定性主要由配基組成、濃度和偶聯(lián)化學(xué)決定，而填料載量與固相載體的性質(zhì)有關(guān)，例如孔徑、孔隙率，甚至固相載體形式。雖然提供定制親和填料服務(wù)的公司可以獲得各種標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)基質(zhì)（表 3），但這些基質(zhì)可能無法為給定目標(biāo)提供最佳孔結(jié)構(gòu)，并且為特定靶點開發(fā)最佳基礎(chǔ)基質(zhì)可能成本高昂，尤其是時間限制。從這個角度來看，使用具有所需親和性的配基測試盡可能多的商業(yè)化基礎(chǔ)基質(zhì)將確?？梢砸院侠淼某杀究焖匍_發(fā)出最佳的生物工藝親和填料。
原則上，在使用傳統(tǒng)填料以商業(yè)上可接受的工藝收率進(jìn)行分離可能非常困難甚至是不可能的情況下，具有精細(xì)選擇性的親和填料也可以用作精純填料。例如，可以從基于親和性的純化步驟中受益的分離挑戰(zhàn)包括異構(gòu)體的分離、目標(biāo)分子的截短形式或治療性酶的活性和非活性形式。事實上，配基發(fā)現(xiàn)和隨后的定制親和填料開發(fā)的最新進(jìn)展表明，親和填料可以解決這些類型的分離問題并且可以快速開發(fā)。例如，據(jù)報道，親和填料能夠分離活性和非活性形式的治療性酶，或分離全長形式和截短形式的生長因子。這種按需提供的高特異性選擇性配基可能會重新定義非平臺化分子未來工藝的開發(fā)模式。該模式設(shè)想設(shè)計的填料可以選擇藥物并去除質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品屬性(QTPP) 中定義的工藝和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)?？梢栽O(shè)計額外的親和填料，以在最少的步驟中獲得所需的QTPP。
在表1中，提供了填料設(shè)計示例。純化挑戰(zhàn)是將 Fc 融合蛋白與密切相關(guān)的產(chǎn)物雜質(zhì)（例如同源二聚體、高分子量物質(zhì)和錯配異構(gòu)體）分離。最初的工藝是基于Protein A 捕獲步驟開發(fā)的，隨后是后續(xù)的精純步驟，以去除剩余的HCP 和密切相關(guān)的產(chǎn)品雜質(zhì)。后者占Protein A 洗脫池的 30%。研究開發(fā)了一種新的親和填料，用于從Protein A 洗脫池中捕獲 Fc 融合蛋白，收率 >95%，純度為99%。有趣的是，當(dāng)使用新填料作為捕獲步驟時，與Protein A 相比，它顯示出 1.5 倍的目標(biāo)動態(tài)結(jié)合載量、38% 的純度增加以及相同的HCP 和 DNA 清除率。
表1. 使用各種親和填料純化 Fc 融合蛋白的工藝選擇比較
分離目標(biāo)蛋白的密切相關(guān)形式的親和配基可以擴(kuò)展靶點專利保護(hù)，因為最終的藥物組成反映了親和填料分離密切相關(guān)形式的能力。因此，競爭對手可能很難使用傳統(tǒng)填料來匹配藥物產(chǎn)品組成。在其它情況下，分離產(chǎn)品形式的親和填料可以提供從使用傳統(tǒng)層析方法的遺留產(chǎn)品生產(chǎn)專利中操作的自由。
Part5 總結(jié)
由于其選擇性、可放大性和易于工藝開發(fā)，AC現(xiàn)在已成為生物藥工業(yè)化生產(chǎn)的首選技術(shù)。雖然天然蛋白質(zhì)配基提供的選擇性尚未與替代結(jié)合劑相匹配，例如適體或低分子量“仿生物”（即從頭設(shè)計的模擬天然生物識別的親和配基），但可以考慮使用其它類型的配基。對于無法獲得天然配基的純化任務(wù)，趨勢是發(fā)現(xiàn)或開發(fā)基于工程穩(wěn)定蛋白質(zhì)或基于支架、抗體片段或更大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的肽的配基。使用展示技術(shù)創(chuàng)建大型蛋白質(zhì)或肽結(jié)合劑候選庫是這一發(fā)展的基礎(chǔ)。定制親和配基和填料技術(shù)的出現(xiàn)將推動AC 在傳統(tǒng)非平臺化生物藥中采用和實施的增加。
雖然本文未涵蓋，但 AC 在生物工藝的其它方面也發(fā)揮著重要作用，包括質(zhì)量控制分析。例如，已使用免疫親和層析實現(xiàn)了用于工藝開發(fā)中質(zhì)量屬性分析的非抗體生物藥的純化。此外，使用Protein A 的分析性 AC 可用于在工藝開發(fā)過程中確定抗體滴度和用于其它抗體定量目的。
AC 填料的成本雖然被認(rèn)為很高，但考慮到填料可以多次使用、提高整體工藝收率以及減少不合格批次的數(shù)量，以每克藥品表示時，其成本實際上相當(dāng)適中。因此，定制AC 概念在商業(yè)和技術(shù)平臺上的成熟，將增加定制親和填料的使用頻率，提高生物藥生產(chǎn)過程的效率并降低COG。
總之，大規(guī)模AC已經(jīng)并將繼續(xù)提供簡化下游工藝操作的強(qiáng)大手段。這不僅適用于可平臺化的分子，例如MAb、FAb 或 AAV，而且也適用于無法從純化平臺中受益的目標(biāo)產(chǎn)品。在后一種情況下，為特定分子開發(fā)的生物工藝定制親和填料將提供與基于親和的平臺工藝相關(guān)的所有好處。
本文為以下文獻(xiàn)內(nèi)容簡介，詳細(xì)內(nèi)容，請參考原文。
原文：K.M.Lacki, F.J.Riske, Affinity Chromatography: An Enabling Technology for Large-Scale Bioprocessing. Biotechnolgy Journal, 2020, https://doi.org/10.1002/biot.201800397.
來源：Internet
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