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預(yù)防性mRNA疫苗應(yīng)對新發(fā)傳染病以及病原體變異展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，由于其結(jié)構(gòu)簡單、能夠快速構(gòu)建，加之“平臺技術(shù)”的加持，現(xiàn)已成為疫苗研發(fā)的前沿技術(shù)，引發(fā)各界的廣泛關(guān)注。RNA的免疫刺激作用早在20世紀(jì)60年代初就已為人所知，但直到1990年直接注射“裸”核酸后，即將體外轉(zhuǎn)錄的信使RNA（mRNA）直接注入體內(nèi)，短暫性地讓基因表達(dá)抗原蛋白的可能性才被證實(shí)。隨著mRNA的穩(wěn)定性的改進(jìn)，包括RNA生產(chǎn)可行性的增加以及伴隨的炎癥反應(yīng)的減少，mRNA疫苗和治療方法的開發(fā)取得了重大進(jìn)展。目前，除新冠疫苗外，利用mRNA技術(shù)制備的狂犬、寨卡、人巨細(xì)胞病毒等傳染病預(yù)防性疫苗已經(jīng)開展臨床試驗(yàn)。

本文基于已上市mRNA疫苗技術(shù)特點(diǎn)，結(jié)合WHO最新發(fā)布的《預(yù)防傳染病mRNA疫苗質(zhì)量、安全及有效性評價(jià)法規(guī)考慮》（Evaluation of the QualitySafety and Efficacy of Messenger RNA Vaccines forthe Prevention of Infectious Diseases: RegulatoryConsiderations），探究mRNA疫苗在非臨床研究和評價(jià)中的關(guān)鍵要點(diǎn)。

一、mRNA疫苗的主要特點(diǎn)

mRNA疫苗研發(fā)速度快。目前，廣泛用于預(yù)防新冠病毒的mRNA主要采用一種新型的無細(xì)胞的酶工藝方式合成，通過使用DNA依賴的RNA聚合酶（如T7、T3或Sp6噬菌體RNA聚合酶）和核苷三磷酸或修飾的核苷三磷酸，在體外由線性DNA模板合成。在標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)定的條件下，無細(xì)胞體外合成技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)mRNA疫苗相對快速的設(shè)計(jì)和直接大規(guī)模生產(chǎn)。相比于傳統(tǒng)疫苗往往需要數(shù)年時(shí)間才能完成的產(chǎn)品開發(fā)，mRNA疫苗在應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速響應(yīng)能力，使其未來在傳染病預(yù)防中將發(fā)揮重要作用。

需要特定的遞送載體。首先，mRNA極不穩(wěn)定，易被免疫細(xì)胞吞噬或被核酸酶降解；其次，mRNA分子量大（104~106 Da）且在生理pH條件下帶負(fù)電荷，難以跨過同為負(fù)電荷的細(xì)胞膜。此外，為避免被溶酶體分解，mRNA被細(xì)胞攝取進(jìn)入體內(nèi)后必須及時(shí)釋放到細(xì)胞質(zhì)中。目前，新冠mRNA疫苗開發(fā)中，進(jìn)展最快的遞送載體是基于脂質(zhì)的納米顆粒（LNP）。

具有明顯的免疫保護(hù)力優(yōu)勢。mRNA疫苗的免疫原理是通過特定的遞送系統(tǒng)將表達(dá)抗原的mRNA導(dǎo)入體內(nèi)，在體內(nèi)表達(dá)出蛋白并刺激機(jī)體產(chǎn)生獲得性免疫應(yīng)答，從而使機(jī)體獲得免疫保護(hù)。相比于傳統(tǒng)滅活疫苗直接將抗原蛋白注射進(jìn)入人體引起免疫應(yīng)答的方式，mRNA在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)后能夠持續(xù)表達(dá)抗原蛋白，直至其被降解，同時(shí)細(xì)胞免疫和體液免疫的雙重機(jī)制，使mRNA疫苗所介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間更長、免疫記憶更強(qiáng)烈。

具有佐劑效應(yīng)。不同于DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，RNA通常以單鏈（ssRNA）存在，但RNA也能形成由短雙鏈片段和中間各種單鏈環(huán)組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。這些RNA作為某些RNA病毒基因組的一種呈現(xiàn)形式，會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體感知，激活對病毒感染的固有免疫應(yīng)答，這些固有免疫應(yīng)答對于激活獲得性免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答十分關(guān)鍵。此外，LNPs根據(jù)其成分也可能具有免疫調(diào)節(jié)作用。

基于mRNA平臺技術(shù)。“平臺技術(shù)”廣義上指使用相同的基本成分作為主干，可通過插入新的基因或蛋白質(zhì)序列來構(gòu)建針對不同病原體的系統(tǒng)，疫苗平臺技術(shù)是由流行病防范創(chuàng)新聯(lián)盟于2017年提出，旨在促使疫苗迅速發(fā)展。使用“平臺技術(shù)”開發(fā)新候選疫苗的意義是，此前獲得的經(jīng)驗(yàn)和信息，包括生產(chǎn)、質(zhì)量控制、穩(wěn)定性和非臨床數(shù)據(jù)等都可以作為支持性數(shù)據(jù)，用于更快速地評價(jià)和開發(fā)新的候選疫苗。此外，平臺技術(shù)提供的關(guān)于安全起始劑量或可耐受劑量方面的臨床和非臨床數(shù)據(jù)也可支持啟動(dòng)新候選疫苗的臨床試驗(yàn)。

二、mRNA疫苗非臨床評價(jià)中的特別考慮要點(diǎn)

對藥效學(xué)研究設(shè)計(jì)的考慮。一是關(guān)注免疫應(yīng)答的持久性或具有持久性的免疫細(xì)胞表型。在非臨床研究中，免疫原性試驗(yàn)考察疫苗在動(dòng)物體內(nèi)引起的與人體相關(guān)的免疫應(yīng)答。mRNA翻譯的抗原片段分別遞呈給CD4+T、CD8+T細(xì)胞或者通過釋放被B細(xì)胞識別，最終激活細(xì)胞免疫和體液免疫，產(chǎn)生免疫抗體，但隨著時(shí)間的推移，疫苗激發(fā)的免疫應(yīng)答水平會(huì)逐漸下降，因此，需要關(guān)注免疫應(yīng)答的持久性或具有持久性的免疫細(xì)胞表型，特別是被認(rèn)為與候選疫苗誘導(dǎo)保護(hù)作用相關(guān)的免疫應(yīng)答持久性，這對于評估后續(xù)劑量的需求（或時(shí)間）至關(guān)重要。二是關(guān)注Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答。過多Ⅰ型干擾素會(huì)導(dǎo)致免疫應(yīng)答終止，為確保疫苗接種的有效性，應(yīng)關(guān)注Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答并對其合理調(diào)控，目前所采取的方法主要通過使用自然修飾的核苷如假尿苷或N1-甲基假尿苷來代替尿苷，可以有效降低宿主的病原模式識別受體對mRNA分子的甄別能力。

對動(dòng)物模型中安全性/毒性研究設(shè)計(jì)的考慮。一是mRNA和LNPs的生物分布和持久性。傳統(tǒng)的在動(dòng)物模型中的毒性試驗(yàn)往往具有局限性，不能準(zhǔn)確推斷一些不良事件的關(guān)聯(lián)因素。為此，WHO建議可通過確定mRNA和LNPs（或脂質(zhì)成分）是否會(huì)從接種疫苗的組織中分散出去、分布到哪些組織、所持續(xù)時(shí)間等，來展開對疫苗安全性的評價(jià)。二是全身和局部的毒性和炎癥反應(yīng)。RNA通過多種途徑引發(fā)炎癥反應(yīng)，特別是通過固有免疫系統(tǒng)及其眾多的RNA傳感器引發(fā)。盡管其中一些活性可能有利于疫苗的免疫應(yīng)答，但重要的是要監(jiān)測全身和局部的毒性和炎癥反應(yīng)，以了解所有免疫應(yīng)答、反應(yīng)原性或毒性，這些將是預(yù)測人類嚴(yán)重不良事件或特別關(guān)注的不良事件的免疫指標(biāo)。三是非自然修飾核苷的非預(yù)期和嚴(yán)重毒性。一些抗病毒藥物和抗癌藥物中，含有特定的非自然核苷類似物，它們的構(gòu)象發(fā)生了改變，產(chǎn)生了線粒體毒性，從而導(dǎo)致了肌病、多發(fā)性神經(jīng)病變、乳酸酸中毒、肝脂肪變性、胰腺炎、脂肪代謝障礙，甚至死亡。然而，這些臨床觀察到的毒性并沒有在非臨床動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)。因此，特別是對于含有非自然修飾核苷mRNA疫苗，這些修飾在其他已開發(fā)的核酸產(chǎn)品中并沒有被完全表征，在安全性評價(jià)中，應(yīng)仔細(xì)考慮如何在合適的動(dòng)物模型和非臨床研究中觀察到這些潛在的毒性。

對脂質(zhì)納米遞送系統(tǒng)中新型脂質(zhì)毒性的考慮。兩款mRNA COVID-19疫苗中的LNP均由中性磷脂、膽固醇、聚乙二醇-脂質(zhì)和可電離的陽離子脂質(zhì)4個(gè)主要成分組成。目前針對LNP的研發(fā)焦點(diǎn)主要針對可電離的陽離子脂質(zhì)的優(yōu)化。不同類型的脂質(zhì)成分會(huì)導(dǎo)致LNPs的理化屬性，如顆粒大小、形態(tài)、封裝效率和表面電荷的差異，進(jìn)而導(dǎo)致不同的安全性，與此同時(shí)，當(dāng)各種脂質(zhì)的比例發(fā)生變化時(shí)，LNPs的理化屬性也會(huì)改變，因此當(dāng)LNPs由新型脂質(zhì)制成或其自身被修飾（例如改變比率或更改工藝），且此前未進(jìn)行過非臨床和臨床測試，則需要對包含的新型脂質(zhì)的材料單獨(dú)開展毒性研究，并關(guān)注其遺傳毒性、生殖毒性等。

對mRNA疫苗的遺傳風(fēng)險(xiǎn)的考慮。對質(zhì)粒DNA疫苗開發(fā)中疫苗核酸可能整合到宿主基因組的擔(dān)憂，此前普遍觀點(diǎn)（包括WHO）認(rèn)為該擔(dān)憂并不適用于mRNA疫苗，無需開展非臨床研究解決，但近期針對BNT162b2的研究發(fā)現(xiàn)，BNT162b2激活并增加了人體細(xì)胞內(nèi)的自主逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE-1基因的表達(dá)，而LINE-1作為細(xì)胞內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠介導(dǎo)RNA在肝細(xì)胞系Huh 7中被逆轉(zhuǎn)錄為DNA，這一發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致需要重新審視mRNA疫苗的整合或遺傳風(fēng)險(xiǎn)，對于這些逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA是否會(huì)整合到細(xì)胞基因組中，未來可能還需要設(shè)計(jì)相應(yīng)研究，如對疫苗接種的人體組織/細(xì)胞進(jìn)行全基因組測序，明確其對基因組完整性的影響。

對mRNA平臺技術(shù)的考慮。WHO認(rèn)為當(dāng)新的候選疫苗是基于特定生產(chǎn)商的平臺技術(shù)，特別是在公共衛(wèi)生突發(fā)事件期間優(yōu)先病原體疫苗快速開發(fā)的情況下，可考慮對非臨床方案進(jìn)行簡化。例如，與監(jiān)管當(dāng)局達(dá)成共識后，基于同一平臺的臨床數(shù)據(jù)或非臨床安全數(shù)據(jù)的類似候選疫苗，可以簡化或免除進(jìn)一步非臨床安全性研究。同樣，同一平臺中當(dāng)使用具有相同摩爾數(shù)和mRNA-脂質(zhì)比的LNP時(shí)，且多價(jià)疫苗中所含mRNA總量不超過單價(jià)制劑非臨床安全性研究中的最高安全劑量時(shí)，單價(jià)疫苗的非臨床安全性數(shù)據(jù)（臨床數(shù)據(jù)）也可以支持多價(jià)疫苗或聯(lián)合疫苗的臨床開發(fā)。在該過程中，應(yīng)始終考慮已知相關(guān)產(chǎn)品和已評價(jià)產(chǎn)品情況，特別是在基于同一平臺技術(shù)的情況下，如有相關(guān)產(chǎn)品的臨床數(shù)據(jù)，在評價(jià)候選疫苗在人體中的安全性時(shí)，可能比任何指定動(dòng)物模型或體外人體模型中獲得的數(shù)據(jù)更有意義。

鑒于當(dāng)前新冠大流行以及新冠mRNA疫苗的研發(fā)速度，WHO發(fā)布的《預(yù)防傳染病mRNA疫苗質(zhì)量、安全及有效性評價(jià)法規(guī)考慮》為監(jiān)管機(jī)構(gòu)評價(jià)mRNA疫苗安全性及有效性提供了指導(dǎo)，具有重要意義。WHO認(rèn)為，在mRNA疫苗非臨床研究設(shè)計(jì)和評價(jià)中需要特別關(guān)注免疫應(yīng)答的持久性或持久性免疫細(xì)胞表型、Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答情況、mRNA和LNPs的生物分布和持久性、全身和局部的毒性和炎癥反應(yīng)、非自然修飾核苷的潛在毒性、脂質(zhì)納米遞送系統(tǒng)中新型脂質(zhì)的毒性等方面問題。雖然這些問題并非與所有mRNA疫苗都存在必然聯(lián)系，但疫苗開發(fā)者或生產(chǎn)商有必要對其加以驗(yàn)證，以便更好地了解候選疫苗的安全性和有效性。此外，應(yīng)該認(rèn)識到，mRNA疫苗介導(dǎo)免疫原性的類型和數(shù)量仍未研究透徹，其安全性也需要更長的時(shí)間觀察，要想成功、廣泛適用和持久有效地預(yù)防目標(biāo)疾病，每種疫苗都要從其收益和風(fēng)險(xiǎn)角度進(jìn)行評估。