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生物指示劑的定義

生物指示劑，簡稱BI，是一類特殊的活微生物制品，是對特定滅菌工藝有一定耐受性并且能夠定量測定滅菌效力的微生物制劑，可用于確認滅菌設(shè)備的性能、滅菌程序的驗證、生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控等。用于滅菌驗證中的生物指示劑一般是細菌的孢子。

制備生物指示劑所用微生物的基本要求

不同的滅菌方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：

（１）菌種的耐受性應(yīng)大于需滅菌物品中所用可能污染的耐受性；

（２）菌種應(yīng)無致病性；

（３）菌株應(yīng)穩(wěn)定，存活期長，易于保存；

（４）易于培養(yǎng)。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90%以上。

生物指示劑的制備

生物指示劑的制備應(yīng)按一定的程序進行，制備前，需先確定所用微生物的特性，如D值等。菌株應(yīng)用適宜的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)物應(yīng)制成懸浮液，其中孢子的數(shù)量應(yīng)占優(yōu)勢，孢子應(yīng)懸浮于無營養(yǎng)的液體中保存。

生物指示劑中包含一定數(shù)量的一種或多種孢子，可制成多種形式。通常是將一定數(shù)量的孢子附著在惰性的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等；孢子懸浮液也了密封于安瓶中；有的生物指示劑還配有培養(yǎng)基系統(tǒng)。D值與滅菌條件相關(guān)外，還與微生物存在的環(huán)境有關(guān)。因此，一定形式的生物指示劑制備完成后，應(yīng)測定D值和孢子總數(shù)。生物指示劑應(yīng)選用合適的材料包裝，并設(shè)定有效期。載體和包裝材料在保護生物指示劑不致污染的同時，還應(yīng)保證滅菌劑穿透并能與生物指示劑充分接觸，載體和包裝的設(shè)計原則是便于貯存、運輸、取樣、轉(zhuǎn)移接種。有些生物指示劑可直接將孢子接種至液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。使用替代品時，應(yīng)用數(shù)據(jù)證明二者的等效性。

生物指示劑的應(yīng)用

在滅菌程序的驗證中，盡管可通過滅菌過程某些參數(shù)的監(jiān)控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性最直觀的指標?？墒褂檬惺鄣臉藴噬镏甘緞?，也可使用由日常生產(chǎn)污染菌中分離的耐受性最強的微生物制備的孢子。在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的D值，并測定孢子的純度和數(shù)量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應(yīng)比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在最終滅菌法中，生物指示劑應(yīng)放在滅菌柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設(shè)定的條件滅菌后取出，分別置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。

過度殺滅產(chǎn)品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產(chǎn)品，設(shè)計滅菌程序時，根據(jù)經(jīng)驗預(yù)計在該生產(chǎn)工藝中產(chǎn)品微生物污染的水平，選擇微生物指示劑的菌種和把瓶子數(shù)量、耐受性和滅菌程序驗證獲得的數(shù)據(jù)進行評估。

常用生物指示劑

濕熱滅菌法

濕熱滅菌法最常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子。D值為1.5~3.0分鐘，每片活孢子數(shù)5×105~5×106個，在121℃、19分鐘下應(yīng)被完全殺滅。此外，還可使用生胞梭菌孢子，D值為0.4~0.8分鐘。

干熱滅菌法

干熱滅菌法最常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子。D值大于1.5分鐘，每片活孢子數(shù)5× 105~5×106個。內(nèi)毒素挑戰(zhàn)去熱原工藝驗證常被用來替代生物指示劑驗證，因為內(nèi)毒素比微生物芽孢更難殺滅。

輻射滅菌法

輻射滅菌法最常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子。每片活孢子數(shù)107~108個，置于放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy。但應(yīng)注意滅菌物品中所負載的微生物可能比較短小芽孢桿菌孢子顯示更強的抗輻射力，因此短小芽孢桿菌孢子可用于監(jiān)控滅菌過程，但不能用于滅菌輻射劑量建立的依據(jù)。

環(huán)氧乙烷滅菌法

在環(huán)氧乙烷滅菌工藝中，常采用枯草芽孢桿菌的亞種，即枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillus subtilis var.niger)的芽孢作為生物指示劑來對該工藝進行控制。環(huán)氧乙烷滅菌中，枯草芽孢桿菌孢子D值大于2.5分鐘，在環(huán)氧乙烷濃度為600mg/L，相對濕度為60%，溫度為54℃下滅菌，60分鐘應(yīng)被殺滅。

液態(tài)過氧化氫滅菌用生物指示劑

在液態(tài)過氧化氫滅菌工藝中，常采用嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢，但也可用梭狀芽孢桿菌芽孢或枯草芽孢桿菌芽孢，還可選用其他類的微生物芽孢，只要證明其對過氧化氫的耐受性不低于上述3種芽孢的耐受性即可。

生物指示劑的實驗室管理

生物指示劑作為一種特殊的物料，為了安全、合理地使用，一般應(yīng)對生物指示劑進行控制管理。

購買的生物指示劑應(yīng)附有相應(yīng)的質(zhì)量報告，內(nèi)容包括微生物種類、含量、D值、有效期等，實驗室在使用前要對BI進行質(zhì)量復核，進行微生物數(shù)量的確認。進行登記并按說明存放。

進行微生物數(shù)量確認時，將原BI的所有含有微生物的部分轉(zhuǎn)移到生理鹽水中，稀釋后進行計數(shù)，與質(zhì)量報告中的數(shù)量進行比較。常用的生物指示劑以紙條、不銹鋼片等作為載體。對于紙條式生物指示劑，因其不易打碎，可在液體中加入無菌的玻璃珠，然后再震蕩打碎，制成紙漿懸液進行計數(shù)。

典型的微生物數(shù)量復核報告包含以下內(nèi)容：NI含菌確認、生產(chǎn)商、菌名、批號、標示含菌量、D值、效期、稀釋過程、稀釋倍數(shù)、計數(shù)結(jié)果、每個BI含菌量、是否合格等。可用將BI的產(chǎn)品質(zhì)量報告或其復印件與上述文件一起存放。檢驗合格的BI要經(jīng)過批準和發(fā)放后才可使用。領(lǐng)用時要登記領(lǐng)用人、日期、數(shù)量等。