摘 要
本文將對(duì)自身對(duì)照法的原理及應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的討論，并重點(diǎn)分析其中存在的無(wú)法避免的系統(tǒng)誤差以及由于該系統(tǒng)誤差導(dǎo)致的不適用情況。
1、概述
自身對(duì)照法是一種常見的雜質(zhì)含量計(jì)算方法，測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，將供試品溶液按一定的稀釋倍數(shù)稀釋作為對(duì)照溶液，稀釋倍數(shù)一般為100倍、500倍、1000倍等。中國(guó)藥典收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文中有關(guān)物質(zhì)的雜質(zhì)含量計(jì)算方法絕大多數(shù)是自身對(duì)照法。自身對(duì)照法一般可分為加校正因子的自身對(duì)照法與不加校正因子的自身對(duì)照法。加校正因子的自身對(duì)照法適用于已知雜質(zhì)（校正因子在0.2-5之間）的計(jì)算，不加校正因子的自身對(duì)照法適用于響應(yīng)與主成分接近（國(guó)內(nèi)要求校正因子在0.9-1.1之間，歐美要求0.8-1.2）的已知雜質(zhì)與未知雜質(zhì)的含量計(jì)算。
2、自身對(duì)照法的系統(tǒng)誤差分析
自身對(duì)照法在計(jì)算雜質(zhì)含量時(shí)，存在兩個(gè)無(wú)法避免的系統(tǒng)誤差：流動(dòng)相本底吸收；供試品雜質(zhì)含量。
（1）流動(dòng)相本底吸收
流動(dòng)相的本地吸收將影響自身對(duì)照法的計(jì)算結(jié)果，且為系統(tǒng)誤差，非隨機(jī)誤差。假設(shè)待測(cè)雜質(zhì)與主成分響應(yīng)一致，流動(dòng)相本底吸收為n，對(duì)照溶液主成分吸收為a，待測(cè)雜質(zhì)吸收為A,稀釋倍數(shù)為k，待測(cè)雜質(zhì)的真實(shí)含量為A/ka，而自身對(duì)照法計(jì)算的雜質(zhì)含量為（A-n）/ka（a-n）。計(jì)算結(jié)果減去真實(shí)結(jié)果的差值為（A-a）n/ka（a-n），由于對(duì)照溶液主成分的吸收a一定大于流動(dòng)相本底吸收n，否則該方法不適用；因此由該公式可看出，當(dāng)A=a時(shí)，計(jì)算結(jié)果與真實(shí)結(jié)果一致；當(dāng)A＞a時(shí)，即對(duì)照溶液主成分濃度小于待測(cè)雜質(zhì)濃度時(shí)，差值為正值，計(jì)算結(jié)果大于真實(shí)結(jié)果；當(dāng)A＜a時(shí)，計(jì)算結(jié)果小于真實(shí)結(jié)果。
計(jì)算結(jié)果不得小于真實(shí)結(jié)果，因此對(duì)照溶液主成分濃度不得大于待測(cè)雜質(zhì)濃度，由此可得出對(duì)照溶液濃度不得超過(guò)待測(cè)雜質(zhì)限度濃度的結(jié)論。從這個(gè)角度看，如雜質(zhì)限度為0.1%，則對(duì)照溶液應(yīng)為供試品稀釋1000倍，不應(yīng)使用1%自身對(duì)照溶液。
從以上討論也可推測(cè)，自身對(duì)照法計(jì)算回收率時(shí)，回收率應(yīng)與濃度呈正相關(guān)，流動(dòng)相本底吸收較大的情況下，低濃度如定量限回收率偏低的風(fēng)險(xiǎn)較大。
該誤差雖不能完全消除，但可通過(guò)優(yōu)化色譜條件較少，即檢測(cè)波長(zhǎng)如遠(yuǎn)大于流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)，且待測(cè)組分的響應(yīng)較強(qiáng)，流動(dòng)相本底吸收可忽略不計(jì)，為了操作便利，在回收率符合要求的前提下，對(duì)照溶液可選擇1%供試品溶液。
（2）供試品雜質(zhì)含量
假設(shè)一種極端情況，所有的雜質(zhì)與主成分響應(yīng)一致，供試品中含有50%的雜質(zhì)，則雜質(zhì)響應(yīng)與主成分一致，通過(guò)自身對(duì)照法計(jì)算的雜質(zhì)含量為100%。這個(gè)結(jié)果可以說(shuō)非?；闹?，但是闡述了一個(gè)顯然的事實(shí)，自身對(duì)照法由于供試品中雜質(zhì)的存在，使得檢測(cè)結(jié)果高于真實(shí)值，如雜質(zhì)含量高到一定程度，檢測(cè)結(jié)果將偏高到無(wú)法接受。
假設(shè)所有的雜質(zhì)與主成分響應(yīng)一致，總雜含量為s，總峰面積為A，則自身對(duì)照法計(jì)算的總雜含量為As/A（1-s），減去真實(shí)總雜含量s，差值為s×s/（1-s），由差值公式可看出，當(dāng)總雜含量s無(wú)限趨近于0時(shí)，自身對(duì)照法的計(jì)算結(jié)果與真實(shí)值一致；總雜真實(shí)值最大值為1，當(dāng)總雜含量無(wú)限趨近于1時(shí)，自身對(duì)照法的計(jì)算結(jié)果為無(wú)窮大。
由以上分析可看出，當(dāng)雜質(zhì)含量較高時(shí)，無(wú)法忽略自身對(duì)照法的系統(tǒng)誤差帶來(lái)的計(jì)算結(jié)果偏大的影響。如計(jì)算降解試驗(yàn)的質(zhì)量守恒，如主成分降解超過(guò)20%，采用自身對(duì)照計(jì)算，總雜含量將偏大4%，這很可能導(dǎo)致質(zhì)量守恒驗(yàn)算不符合要求。筆者認(rèn)為，對(duì)于雜質(zhì)含量較大的供試品，如總雜超過(guò)5%，不建議使用自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量，此處的總雜是廣義上的總雜，包括殘留溶劑、水分、有關(guān)物質(zhì)等；該情況下可采用主成分外標(biāo)法或者面積歸一化法。
3、后述
自身對(duì)照法具有不用使用對(duì)照品，在樣品較少的情況下操作便利的優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)于多個(gè)樣品，制備對(duì)照溶液較為繁瑣，不如主成分外標(biāo)法方便；且其存在不能克服的系統(tǒng)誤差，因此筆者建議同仁們多嘗試使用主成分外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)含量。
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