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前言

高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）是制藥行業(yè)分析檢測的主要手段，其中HPLC的運(yùn)用更加廣泛，常見的包括正相色譜法（NPLC）、反相色譜法（RPLC）、離子交換色譜法（IEC）、親水作用色譜法（HILIC）等，是分析工作者首當(dāng)其沖需要掌握的一門技術(shù)。

高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成圖片。要做好HPLC分析方法開發(fā)，其中的關(guān)鍵組成部分（進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測器）的基礎(chǔ)知識必須掌握。

筆者此文圍繞上述關(guān)鍵組成部分展開，旨在分享一些HPLC分析方法開發(fā)必備的基礎(chǔ)知識點(diǎn)。

知識點(diǎn)1-檢測器

檢測器是觀測化合物出峰的“眼睛”，“選定檢測器”則是HPLC方法開發(fā)的第一起點(diǎn)，不同的檢測器類型對應(yīng)著方法可能達(dá)到的靈敏度上限、可選擇的流動相范圍（是否揮發(fā)性）、可選擇的洗脫方式（梯度洗脫/等度洗脫）、操作是否便捷、實(shí)驗(yàn)的成本及方法轉(zhuǎn)移的成本，一旦選定了檢測器類型，就意味著方法開發(fā)的外邊界確定了（比如：選定了ELSD，則流動相不可含用磷酸鹽等非揮發(fā)性成分；選定了RID，則不建議采用梯度洗脫程序）。

因此，檢測器的選擇尤為關(guān)鍵，要做好分析方法開發(fā)，常見的檢測器原理、適用范圍、使用限制必須了解，下圖可做參考圖片。

讀者應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況，如“是否為痕量測定、待分離組分的復(fù)雜程度、待測化合物的性質(zhì)（是否有紫外吸收、是否為可激發(fā)熒光的物質(zhì)）、實(shí)驗(yàn)室已有的設(shè)備資源、轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備資源”綜合考慮。

知識點(diǎn)2-進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣系統(tǒng)不是影響分析方法開發(fā)成敗的關(guān)鍵點(diǎn)，但不合適的進(jìn)樣系統(tǒng)，必然成為分析方法開發(fā)路上的絆腳石。

進(jìn)樣系統(tǒng)的關(guān)鍵在于“進(jìn)樣溶劑、進(jìn)樣體積、進(jìn)樣溫度以及洗針溶液”。

進(jìn)樣溶劑，即供試品的稀釋溶劑，在滿足樣品溶解度和溶液穩(wěn)定性的情況下，以初始比例流動相作為首選進(jìn)樣溶劑，以避免溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生，如需采用其他進(jìn)樣溶劑，應(yīng)考慮溶劑的洗脫強(qiáng)度、溶劑的pH及其緩沖能力。

進(jìn)樣體積過小，影響進(jìn)樣精密度和靈敏度；進(jìn)樣體積過大，降低分離效果、甚至?xí)驗(yàn)轶w積過載從而導(dǎo)致峰平頭。針對幾種不同的色譜柱構(gòu)造，它們的最大建議進(jìn)樣體積見下表圖片，其他規(guī)格的色譜柱可參考下表進(jìn)行調(diào)整。

進(jìn)樣溫度指的是控溫盤的溫度，僅在供試品溶液需要低溫條件以保持穩(wěn)定的情況下才開啟。方法開發(fā)過程中，采用一個(gè)已經(jīng)變壞的供試品溶液（雜質(zhì)譜發(fā)生變化，不具代表性）是大忌。

洗針溶液通常采用不含鹽的初始比例流動相，反相色譜洗針液也常用50%甲醇-水溶液，若產(chǎn)生進(jìn)樣殘留，可以結(jié)合殘留物的溶解性質(zhì)適當(dāng)增減有機(jī)相比例或者調(diào)節(jié)洗針液的酸堿性。

知識點(diǎn)3-分離系統(tǒng)

分離系統(tǒng)是HPLC分析方法開發(fā)的靈魂。分離系統(tǒng)不是色譜柱的獨(dú)舞，而是色譜柱、流動相、待測樣品等共同譜寫的交響樂。

待測樣品通常需要掌握其組分的復(fù)雜程度（基質(zhì)、待測組分的數(shù)量）用于判斷樣品是否需要經(jīng)過特殊的前處理、是否優(yōu)先考慮梯度洗脫?；衔锏膒Ka、logP（商業(yè)化軟件ACD可以給出pH-logD曲線，直觀展現(xiàn)化合物在不同pH條件下的親脂性）用于評估化合物的保留能力、輔助分離模式篩選、提供流動相緩沖溶液的pH選擇依據(jù)?；衔锏姆肿恿坑糜谶x擇匹配的色譜柱孔徑，孔徑大小在8~12nm的全孔和表面多孔的顆粒最常用于分子量小于10000Da 的分子，大于10000Da的分子通常采用30nm孔徑的色譜柱圖片。

流動相通常涉及以下幾個(gè)方面：流動相pH（視情況選擇具有緩沖能力的緩沖鹽，以保證化合物穩(wěn)定的分子-離子形態(tài)，防止保留時(shí)間飄移；特殊情況如需改善峰形和保留，可能還需要使用離子對，一旦使用離子對就需要專柱專用）；有機(jī)相種類（反相色譜中最常用的是甲醇和乙腈，乙腈的洗脫強(qiáng)度大于甲醇，甲醇的氫鍵作用更強(qiáng)、乙腈還可提供偶極作用）；等度或梯度洗脫（依據(jù)待測組分的復(fù)雜程度和實(shí)際分離效果選擇）。

色譜柱的選擇可以從以下方面考慮：色譜柱的固定相種類（分離模式是反相/正相/HILIC/手性/離子交換，選擇與分離模式匹配的色譜柱，其中反相色譜柱種類繁多，重點(diǎn)關(guān)注基質(zhì)類型、是否封端、鍵合官能團(tuán)等）、粒徑（粒徑越小，柱效越高，但背壓越大）、孔徑（選擇與化合物分子量匹配的孔徑）、比表面積（比表面積越大，鍵合相覆蓋率越高，保留能力、柱容量、柱效越高）、碳載量（碳載量越高，疏水保留能力越高）、柱溫（一般情況下，柱溫升高，出峰變快，峰寬越窄，分離效果更好，可設(shè)計(jì)具體實(shí)驗(yàn)觀測柱溫對實(shí)際分離效果的影響，注意實(shí)驗(yàn)溫度不要超過色譜柱的耐受范圍）。市面上的色譜柱很多，如何從成百上千的色譜柱中選出心儀的色譜柱確實(shí)是個(gè)技術(shù)活，我們也不可能一根根的去盲試，故而需要分析工作者具備一定的判斷能力，除了考量上述廠家給出的色譜柱參數(shù)，反相色譜柱還可以利用一些標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行柱篩選，如USP網(wǎng)站上的柱參數(shù)（基于疏水減法模型，將色譜柱作用力歸結(jié)為疏水作用、氫鍵作用、離子作用、形狀選擇作用），擁有ACD軟件的企業(yè)則可以通過特有的柱篩選模塊更直觀、便捷的進(jìn)行柱選擇。其他分離模式的色譜柱，一般可以通過參考廠家給出的案例進(jìn)行柱選擇。當(dāng)然，現(xiàn)在很多的色譜柱廠家有自己的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，為了色譜柱更好的銷售，也提供免費(fèi)的分析方法開發(fā)，分析工作者也可嘗試?yán)脧S家提供的資源來解決問題。

參考文獻(xiàn)：

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