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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-08-15 09:26
中樞神經系統(tǒng)感染病原體宏基因組測序試劑是指對來源于腦脊液等人體樣本中的中樞神經系統(tǒng)感染病原體的DNA進行體外定性檢測的試劑，預期用途為中樞神經系統(tǒng)感染的輔助診斷。該類產品在臨床中的應用日趨廣泛，有關專家共識也于近年陸續(xù)發(fā)布。相關產品的研發(fā)和申報也成為目前業(yè)界的熱點之一。
本研究根據(jù)筆者的工作實踐，介紹了對中樞神經系統(tǒng)感染病原體宏基因組測序試劑質量評價的關注點以及涉及檢測的病原體范圍、企業(yè)參考品的設置、反應體系的研究以及分析性能評估的主要內容。旨在通過梳理企業(yè)在產品研發(fā)過程中面臨的共性問題，助力相關產品的臨床應用。
１、 反應原理
中樞神經系統(tǒng)感染是由于病原體侵犯腦和脊髓的實質、被膜及血管引發(fā)的炎性或非炎性疾病。中樞神經系統(tǒng)感染病原體包括病毒、細菌、真菌、螺旋體、立克次體以及寄生蟲等。用于檢測中樞神經系統(tǒng)感染病原體的常用分子生物學檢測技術有封閉巢式多重PCR熔解曲線法、可逆末端終止測序法以及聯(lián)合探針錨定聚合測序法等。
中樞神經系統(tǒng)感染病原體宏基因組測序試劑的反應原理基于高通量測序技術，首先從患者的腦脊液樣本中提取核酸，構建DNA測序文庫，然后上機測序，獲得序列信息。最后通過結果分析軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析，判斷疑似患者是否感染以及感染何種病原體。宏基因組測序理論上可以對不明病因的中樞神經系統(tǒng)感染的全部潛在病原體進行檢測。該類產品可與常規(guī)生物化學檢查、病原體培養(yǎng)或傳統(tǒng)PCR檢測方法聯(lián)合使用，為疑難危急重癥以及罕見病原體感染的診斷提供了有效手段。目前的技術路線可分為檢測病原體游離（cell-free）DNA和全細胞（whole cell）DNA兩大類[1-4]。
2、 檢測的病原體范圍
宏基因組方法可以無靶向地檢測樣本中的病原體。為充分驗證該類產品對病原體的檢測能力，需要確定有充分代表性的病原體檢測范圍，具體為中樞神經系統(tǒng)感染的常見致病菌及具有較大臨床需求的其他致病菌（如使用其他檢測手段容易漏檢的致病菌等）。
代表性病原體確定的主要原則包括：①具有臨床使用價值，在臨床廣泛應用、備受臨床關注的病原體；②具有系統(tǒng)生物學的代表性，覆蓋病毒、細菌、真菌和寄生蟲等主要系統(tǒng)大類；③具有技術驗證的代表性，技術層面較難檢測的病原體；④具有可及性，在臨床上發(fā)生頻率相對較高。
鑒于宏基因組方法對于RNA檢測的靈敏度較低，應用尚不成熟，因此，本研究僅討論宏基因組方法用于DNA檢測的內容。
3、 企業(yè)參考品的設置
企業(yè)應在保證產品原材料和生產工藝穩(wěn)定可靠的基礎上，科學合理地設置企業(yè)參考品，并相應地進行產品性能驗證以及后續(xù)的產品檢驗。
企業(yè)參考品中病原體的種類及濃度量值，應滿足臨床使用需求。其中陽性參考品、檢測限參考品應包括聲稱可檢出的病原體主要亞型，陽性參考品應設置不同濃度。陰性參考品應根據(jù)最終確定的靶標病原體補充可能產生交叉反應的其他病原體以及干擾樣本。重復性參考品至少包括弱陽性水平。如果涉及將病原體DNA提取后打斷制備企業(yè)參考品，還應對打斷后核酸片段的長度進行研究，以證明可以充分模擬真實樣本中的病原體游離DNA。另外，明確企業(yè)參考品的人源核酸背景基質，如為模擬基質，須說明制備方法和組成情況，并提交能夠充分模擬真實樣本的證據(jù)。
4、 反應體系的研究
4.1 樣本處理方法的研究
對于每類病原體，分別評價并比較物理研磨、化學裂解、酶消化等樣本前處理方法對于產品性能的影響，以保證產品能夠實現(xiàn)檢測厚壁的真菌以及胞內寄生菌。另外分別評價并比較不同的去除宿主基因組的方法、是否破除細胞壁、柱提取或者磁珠提取方法、超聲/酶/轉座酶等核酸片段化方法對于產品性能的影響。
研發(fā)人員需對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、病毒等微生物的核酸提取性能驗證，避免漏檢。不同的核酸提取試劑也需要驗證包括核酸提取效率，提取后核酸濃度、純度、完整性，精密度和抗干擾能力等研究及功能性試驗。
4.2 濕試驗檢測流程的研究
開展對臨床樣本用量、試劑用量、反應條件（包括測序讀長以及單雙側、測序深度及檢測數(shù)據(jù)量等）的研究。明確文庫質控要求及檢測方法，產品檢測結果的質量控制指標應不低于相關行業(yè)共識的要求，例如建議有效測序數(shù)據(jù)量不低于20M，對于檢出序列數(shù)測序讀長50bp以上等。由于不同類型的病原體基因組大小以及核酸提取效率存在差異，故應分類解讀結果。例如顯著區(qū)分于人基因組的病毒閾值為3/100萬以上考慮可信，真菌閾值為5/100萬以上考慮可信，胞內菌閾值為1/100萬以上考慮可信，寄生蟲閾值則為10/100萬以上考慮可信。原始試驗數(shù)據(jù)包括文庫制備起始量、標簽接頭、pre-PCR文庫編號、混合文庫編號、混合文庫濃度、post-PCR文庫濃度、下機總數(shù)據(jù)量、Q20%、Q30%、平均深度、檢出病原體序列數(shù)、病原體基因組覆蓋率、病原體相對豐度、病原體絕對豐度、特異性測序讀長、文庫片段分布。同時應開展樣本去宿主細胞或核酸的方法建立的研究。如適用，還須提供背景病原微生物扣除的信息。另外試劑盒中應合理設置內參以及陰陽性對照[5]。
5、分析性能評估
應在主要原材料和反應體系經過確認、生產工藝得到有效控制且保證產品質量穩(wěn)定的基礎上，制訂方案并開展相應的研究。試驗人員應經過必要的培訓，熟悉檢測系統(tǒng)的操作程序和試驗方案，嚴格執(zhí)行質量控制。在對結果進行數(shù)據(jù)檢查后，選擇適當?shù)慕y(tǒng)計方法進行分析，并形成研究報告。以下闡述了該類試劑主要性能的評價內容，包括樣本類型以及研究方法等。對于性能評估用的所有樣本，均應采用性能可靠的方法對含有病原體的種類進行確認，包括但不限于已上市的PCR檢測試劑、測序、數(shù)字PCR、G試驗、GM試驗、病原體特異性抗體或抗原的血清學試驗等[6-7]。
5.1 最低檢測限
每種病原體均應通過對含有已知濃度的1~5個菌株、毒株或血清型的系列稀釋樣本進行檢測，用來確定申報試劑的檢出限。然后可通過對含有檢出限濃度病原體的樣本進行20次重復檢測來驗證檢出限。對于細菌和真菌，檢出限以CFU或細胞數(shù)表示；病毒以感染單位（如CFU）表示。同時明確宿主細胞或宿主DNA濃度，對不同濃度宿主含量條件下的最低檢出限進行研究，須考慮臨床可見最高濃度宿主細胞或者宿主來源的DNA作為基質成分對不同濃度病原體核酸進行檢出限的確定和驗證。
5.2 包容性
選擇能夠代表檢測病原體包容性的病原體菌株、毒株或血清型的樣本等進行檢測，所選樣本能夠代表病原體相關的種屬、亞種或血清型，每種病原體應包含5~10個樣本。應在檢出限濃度水平進行檢出限驗證，并在1.5~3倍檢出限的水平進行重復性驗證。另外對本產品可以檢測卻無法進行實驗測試的罕見病原體進行生物信息學分析以預測其反應性。
5.3 分析特異性
分析特異性包括交叉反應、干擾試驗和競爭性抑制研究等。交叉反應建議以生物信息學分析為補充，確定潛在的交叉反應性序列或微生物。例如，生物信息學分析表明，流感嗜血桿菌檢測可能與溶血嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌和唾液嗜血桿菌發(fā)生交叉反應；腸道病毒檢測可能與鼻病毒發(fā)生交叉反應；新型隱球菌可能與淀粉隱球菌發(fā)生交叉反應。應通過試驗確認上述生物信息學分析所預測的病原體的交叉反應性。交叉反應研究病原體濃度要求細菌為≥1.0×106CFU/mL，病毒為≥1.0×104U/mL，真菌和原生生物為≥1.0×105 U/mL；種類可參考以下情況：腦脊液中的腦膜炎/腦炎非靶標病原體，包括境內常見以及不常見的微生物；可能存在腦脊液中的，可能不會導致腦膜炎/腦炎的非靶標病原體，包括院內感染的微生物、與免疫功能不全相關的微生物，污染或共生微生物，從其他感染部位播散至腦脊液的微生物；與靶標病原體相鄰種系的微生物，包括相同種屬不同類型的微生物；相同的屬或科，人類共生或者可能存在于腦脊液中的微生物；相同的屬或科，不存在于腦脊液中的微生物；不同屬但密切相關的微生物。通過生物信息學識別交叉反應風險，包括人類共生微生物并罕有腦膜炎/腦炎報道，無臨床相關性的微生物。
干擾試驗應對代表性病原體分別在其2~3倍最低檢測限（limit of detection, LOD）水平進行干擾研究。須評估腦脊液樣本中可能存在的或在樣本采集和檢測時可能引入的潛在干擾物質對產品檢測性能的影響，包括乳酸、白細胞、免疫球蛋白、人全血和人類基因組DNA等內源性物質和轉運培養(yǎng)基、消毒劑等，并提供干擾物質濃度選擇依據(jù)。外源性藥物包括針對中樞神經系統(tǒng)感染常用抗病毒藥物、抗真菌藥物及抗生素。競爭性抑制為評估潛在競爭性或干擾性病毒及其他微生物對產品檢測結果的影響。需在每種病原體2~3倍LOD水平，對高濃度的可檢出的其他病毒、細菌或真菌進行競爭性抑制研究。如適用，還需進行攜帶和交叉污染的研究。
5.4 精密度
應考慮不同研究地點、日內/日間、操作者間、產品批次間以及不同儀器間帶來的潛在變異，采用涵蓋全部代表性病原體的菌株、毒株或血清型的不同排列組合的樣本進行精密度研究，樣本需包含陰性、弱陽性（1.5~3倍LOD）和中等陽性濃度水平。另外建議采用ANOVA方法，對總精密度的不同變異分量進行統(tǒng)計分析。
6、總結與展望
目前宏基因組測序技術在中樞神經系統(tǒng)感染病原體核酸檢測方面的應用逐漸廣泛，針對產品設計開發(fā)過程中存在的技術難點以及規(guī)范性問題，本研究結合定性檢測體外診斷試劑分析性能評估技術指南文件、相關專家共識等，就產品性能評估的研究內容以及質量控制的關鍵要素進行了初步探討。希望能夠幫助相關企業(yè)大幅提高產品研發(fā)的效率，從而加速高質量的產品上市，真正使得醫(yī)生和患者受益。
參考文獻
[1] 《中華傳染病雜志》編輯委員會. 中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識[J]. 中華傳染病雜志, 2020, 38(11): 681-689.
[2] 中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會. 高通量宏基因組測序技術檢測病原微生物的臨床應用規(guī)范化專家共識[J]. 中華檢驗醫(yī)學雜志, 2020, 43(12): 1181-1195.
[3] CHIU C Y, MILLER S A. Clinical metagenomics[J]. NatRev Genet, 2019, 20(6): 341-355.
[4] MILLER S, NACCACHE S N, SAMAYOA E, et al.Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencingassay for pathogen detection in cerebrospinal fluid[J].Genome Res, 2019, 29(5): 831-842.
[5] 宏基因組學測序技術在中重癥感染中的臨床應用共識專家組, 中國研究型醫(yī)院學會膿毒癥與休克專業(yè)委員會,中國微生物學會微生物毒素專業(yè)委員會, 等. 基因組學測序技術在中重癥感染中的臨床應用專家共識(第一版)[J]. 中華危重病急救醫(yī)學, 2020, 32(5): 531-536.
[6] 國家藥品監(jiān)督管理局. 關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告(2021年第122號)[EB/OL]. (2021-09-29) [2023-09-01]. https://www.nmpa.gov.cn/ylqx/ylqxggtg/20210930161420143.html.
[7] 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心. 定性檢測體外診斷試劑分析性能評估注冊審查指導原則(2022年第36號)[EB/OL]. (2022-09-28)[2023-09-01]. https://www.cmde.org.cn//flfg/zdyz/zdyzwbk/20221008110559100.html.
【文章來源】中國醫(yī)療器械雜志 監(jiān)管與測試 2024年第48卷第3期
來源：Internet
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