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自從1960s年代雙特異性抗體概念提出，到雜交瘤技術、knobs-into-holes技術的發(fā)展，TCE已經(jīng)取得了長足進步，并陸續(xù)進入市場，造福腫瘤患者。已經(jīng)獲批的TCE靶點包括CD3/CD20、CD3/BCMA、CD3/CD19、CD3/GPRC5D、CD3/DLL3等。典型的TCE結(jié)構(gòu)是個三聚合物，由TCE、T細胞和腫瘤細胞組成，通過T細胞激活，釋放炎癥因子和細胞毒性分子，殺傷腫瘤細胞。考慮到TCE的免疫激活特點，首次臨床起始劑量（FIH）選擇通?；贛ABEL（minimal anticipated biological effect level）方法。MABEL方法主要采用的體外藥理學活性試驗（pharmacological activity assays）終點進行計算。關于體外藥理學活性試驗如何影響MABEL計算起始劑量，其實是有一些細節(jié)需要考慮的，并不是隨便選擇一個細胞試驗的結(jié)果就拿來計算起始劑量。TCE免疫激動劑屬于高活性產(chǎn)品，起始劑量計算可能失之毫厘差之千里，過低會影響臨床進度、成本和患者倫理，過高則會引入安全性風險。

可以從六個變量著手分析：1）靶細胞來源和靶點表達水平；2）效應細胞來源；3）效靶比（E:T ratio）；4）孵育時間；5）試驗終點選擇；6）ECx.

靶細胞來源和靶點表達水平

理想的靶細胞來源是什么？是原代細胞還是細胞系？還是不同細胞來源的靶細胞均可以？理論上，患者來源的細胞/腫瘤（patient-derived cells/tumors, PDCs）比細胞系（cell lines）在靶點表達水平、腫瘤異質(zhì)性和T細胞殺傷敏感性方面，與人體的相關性更強。如果采用靶點表達密度與臨床不相關的細胞系進行計算，得到的劑量不一定適用于臨床目標人群。但是，采用PDCs也有挑戰(zhàn)，一是來源問題，不易獲??；二是樣本間的變異，尤其是實體瘤。細胞系的優(yōu)勢是可獲得性、結(jié)果的均一性會更好。如果無法獲得PDCs，不得不使用細胞系時，需謹慎選擇有代表性的細胞，并考量靶點表達水平的生理相關性。

效應細胞來源

應該采用什么樣的效應細胞開展TCE的體外活性研究呢？PBMC、全血、純化的T細胞還是活化的T細胞？通常來講，患者來源的PBMC含有更豐富的免疫細胞分類，比純化的或活化的T細胞更合適。全血包括所有的血液成分，如果某些靶點除了膜表達，還有一定比例的可溶性占比，那么采用全血作為效應細胞，能提供更多的信息。這點我的理解是，某些膜靶點如BCMA，也會被酶或者其它方式切掉，產(chǎn)生一部分的游離可溶性靶點，而可溶性靶點也是可以結(jié)合TCE的。對于這類靶點，PBMC就不如全血的臨床相關性更強一些。當然，采用全血作為效應細胞的方法相較于PBMC，更具挑戰(zhàn)和難度。最理想的效應細胞應該是患者來源的效應細胞或患者腫瘤中駐留的T細胞，這類細胞代表了患者體內(nèi)真正的殺傷細胞，但這類效應細胞的來源、變異面臨一些挑戰(zhàn)。另外，患者來源的PBMC雖然比健康人的效應功能更弱，但與預期臨床活性卻更為相關。

關于靶細胞、效應細胞選擇對FIH起始劑量選擇的影響，有個不錯的案例。Teclistamab是一款CD3/BCMA雙特異性TCE，采用MM.1R細胞系作為靶細胞，純化的健康人T細胞作為效應細胞，效靶比為5:1，EC20作為計算依據(jù)，獲得的FIH起始劑量為0.3μg/kg。這一劑量其實有些過于保守，比teclistamab后續(xù)step-up首劑量60μg/kg低了200倍。后續(xù)回顧性分析發(fā)現(xiàn)，如果采用PDCs作為靶細胞，起始劑量至少可以提高10倍。如果采用患者PBMC作為效應細胞，效果則會更好。畢竟健康人的PBMC本身就可能比患者效應功能更強，更何況是純化的T細胞。

效靶比（E:T ratio）

確定了靶細胞和效應細胞，接下來的問題便是應該設置什么樣的效靶比最為合適。效應細胞：靶細胞的比例越高，比如3:1、5:1、10:1，會影響EC50或EC20值，過高估計待測產(chǎn)品的活性，導致更低的起始劑量。并不是每個適應癥對應一個統(tǒng)一的效靶比，畢竟每個患者的免疫狀態(tài)和靶負荷不同。臨床比較常見的一個場景是患者經(jīng)過標準治療（以化療居多）后，免疫細胞大幅降低，之后腫瘤進展，腫瘤負荷增加，形成的局面是效靶比明顯降低。另外，對于免疫細胞浸潤比較少的冷腫瘤，效靶比也很低。來自Genentech的Michael Z. Liao等人（2020），評估過一款治療胃癌的TCE產(chǎn)品，10:1和1:5的效靶比相比，獲得的FIH起始劑量低10倍。

解決效靶比的其中一個路徑是采用患者的腫瘤樣本進行效靶比檢測，根據(jù)真實的效靶比情況設計體外活性試驗方案。如果拿不到患者樣本，可以查詢有沒有公開文獻報道。

通常來講，血液瘤的效靶比較實體瘤更高，前者可以考慮1:1，后者則可以考慮1:5或者1:10，預期與臨床相關性更好。當然，前提是1:1的效靶比在體外試驗中能觀察到功能信號，即對設置的終點有響應。如果因效靶比太低，導致劑量-反應關系不明顯，可以借助定量系統(tǒng)藥理學（QSP）模型輔助進行劑量-反應關系預測。

孵育時間

靶細胞和效應細胞的孵育時間決定了反應是否達到了Emax，即最大效應。時間點設置因TCE分子設計、靶點等而異。孵育時間過久會導致人為誤差，過度高估產(chǎn)品活性，影響起始劑量設計?？梢酝ㄟ^表征不同時間點的活性，進行動態(tài)評估，找到Tmax（time to max effect）。如果采用細胞因子作為體外試驗的終點指標，考慮到細胞因子隨時間延長，分泌增加，且體內(nèi)-體外相關性尚不完全清楚。故，通常建議細胞因子的檢測，取早期時間點如24h或48h更合適一些。

試驗終點選擇

TCE常見的體外活性終點包括T細胞激活（CD69+、CD25+）、細胞毒性、細胞因子釋放等。哪個終點用于MABEL計算相關性更好？如果T細胞激活或者細胞毒性作為最敏感的終點還好，倒沒有太多講究。唯一需要提醒的是，如果效靶比太低，以細胞毒性作為試驗終點，劑量-反應關系的獲得可能是個挑戰(zhàn)。CD25和CD69的區(qū)別是，CD69作為T細胞激活的early marker，用于測定給予起始劑量后的early activity，相關性更好。

如果采用細胞因子作為終點指標，卻是有一些注意事項需要考慮。細胞因子是白介素、干擾素、腫瘤壞死因子等一系列小分子蛋白質(zhì)或多肽的混合物。其中IL-6和其他促炎因子（如IL-1b）與CRS機制最為相關。選擇細胞因子作為試驗終點的挑戰(zhàn)性體現(xiàn)在兩點，一是受不同donor個體間的高變異影響，二是細胞因子是一組組合物，單一細胞因子的意義有限，最好能看到關鍵細胞因子的共同升高，如TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-1、IL-6。比如CD3/GPRC5D雙抗talquetamab，發(fā)現(xiàn)IL-10是最敏感的試驗終點，EC20為0.032nM?？紤]到其他細胞因子的升高水平不如IL-10那么敏感，且個體間變異很大，最后選擇了T細胞激活標志物CD25作為起始劑量計算依據(jù)，較IL-10計算的劑量高2.5倍。CD3/CD20雙抗odronextamab則不同，本品體外活性觀察到TNF-α、IFN-γ、IL-6均升高，且EC50介于0.3-0.5nM，敏感度類似。

ECx

所謂ECx，是指選擇EC20、EC30還是EC50作為計算依據(jù)。毫無疑問，EC20、EC30獲得的劑量會更為安全，同時也意味著比較保守。大部分TCE，采用EC50獲得的起始劑量是可以接受的。來自合適的體外藥理學試驗數(shù)據(jù)，F(xiàn)DA也同意采用EC50進行MABEL計算。當然，對于全新靶點，且有off-tumor表達，可以考慮采用更保守的EC20、EC30，其他情況可以考慮以EC50進行計算。

案例

下表羅列了4個TCE雙抗的MABEL法計算FIH起始劑量的體外藥理試驗特點。Teclistamab靶細胞除了細胞系，也采用了PDCs，且基于PDCs獲得的劑量與step-up劑量更為接近?？赡艹鲇诎踩钥紤]，最終選擇的更保守的細胞系來源的數(shù)據(jù)。效應細胞來源方面，健康人血樣可獲得性更強，用的最多。另外，效靶比偏高，5:1、10:1為主。孵育時間介于24-48h。試驗終點細胞毒性、T細胞激活均可。Odronextamab也采用了細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6進行了計算，且能得到更高，相關性更好的起始劑量。不過，很明顯，大多數(shù)TCE產(chǎn)品選擇了更為保守的策略。相信隨著TCE研究數(shù)據(jù)的積累，MABEL計算FIH起始劑量會更科學、更理性。