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細菌內(nèi)毒檢查法作為控制藥品質(zhì)量的一種常規(guī)、經(jīng)濟、有效方法，但是，在為新化合物或者新藥建立細菌內(nèi)毒素檢查方法時，常常會遇到各種各樣的困難，尤其是尚處在新藥研發(fā)早期階段的藥物，由于藥物制劑、賦性劑等不穩(wěn)定給方法的建立帶來不同程度的影響。

 

近日在對比審核新版ChP內(nèi)容，特將兩版《中國藥典》1143細菌內(nèi)毒素檢查法進行對比:

根據(jù)上表對比分析，2025版《中國藥典》對細菌內(nèi)毒素檢測法的核心內(nèi)容、操作要點等內(nèi)容無修訂，說明目前內(nèi)毒素檢測法對于現(xiàn)在市場或技術是滿足的；在光度檢測技術內(nèi)容上無任何修改，也側面說明目前該方法技術驅(qū)動不強或方法革新無任何推動。該次主要修訂在內(nèi)毒素限值、鱟試劑靈敏度復核試驗有效性和細化檢測方法等方面完善。因此該次2025版ChP修改對企業(yè)或者市場影響不大。

 

在藥典中明確規(guī)定供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗，當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗結果為準。在此僅從一種新藥（X注射劑）的細菌內(nèi)毒素方法建立及其檢測角色出發(fā)，在此淺談細菌內(nèi)毒素檢查法-凝膠限度法。

 

 原理：通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理進行限度檢測或定量檢測內(nèi)毒素的方法。

 

 方法建立工作需要系統(tǒng)化完成以下關鍵步驟，確保方法的科學性、合規(guī)性、可重復性。   

 

 

1.內(nèi)毒素限值（L）的確認：一個藥品在投放市場前，它是否滿足內(nèi)毒素限值要求？樣品內(nèi)毒素含量具體是多少？這些問題不但關注用藥安全，還最大限度的提供有關內(nèi)毒素含量的準確信息，為藥品生產(chǎn)中質(zhì)量控制提供警戒信息，盡管內(nèi)毒素檢查法的建立是一個科學方法的研究過程，但其最終目的還是要為控制藥品質(zhì)量服務，因此，在方法建立時，不但要闡明限值的合理性，考慮技術可能達到的限值，同時還要滿足相關藥品管理法規(guī)的要求。

 

內(nèi)毒素限值L的公式計算：L=K/M，舉例其中已知X注射劑的K=5EU/（kg.h），X注射劑的人體最大用量為每小時1.2g，按照我國人均體重60Kg計算，M=1.2g/h ÷60Kg=0.02g/kg.h=20mg/kg.h，即X注射劑內(nèi)毒素限值L=K/M=0.25EU/mg，假定藥品X的濃度為100mg/ml，那么內(nèi)毒素限值L=0.25EU/mg ×100mg/ml=25EU/ml。

 

2. 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：MVD是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，對產(chǎn)品進行最大倍數(shù)的稀釋，仍能夠進行內(nèi)毒素限值的檢測，此時所允許稀釋的最大倍數(shù)。計算公式：MVD=內(nèi)毒素限值（L）×藥品濃度（C）÷鱟試劑靈敏度（λ），鱟試劑有多種規(guī)格，比如0.03EU/ml、0.06EU/ml、0.25EU/ml。根據(jù)上步確認L為0.25EU/mg，假定藥品X的濃度為10mg/ml，當選擇0.25EU/ml的鱟試劑，即MVD=10；當選擇0.03EU/ml的鱟試劑，MVD=83。

 

最小有效濃度（MVC）是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，將產(chǎn)品稀釋到一定濃度，仍能夠進行內(nèi)毒素限值的檢測，此時所允許的最小濃度。MVC=鱟試劑靈敏度（λ）/內(nèi)毒素限值（L）。

 

對選定的鱟試劑靈敏度來講，MVC時一個絕對值，MVD對特定的藥品濃度時特異的，濃度變化時，MVD也會隨之發(fā)生變化。

 

3. 供試品溶液的制備：確認藥品基本信息：藥品的分子量大小、規(guī)格、濃度、體積等，以便選擇合適的藥品處理方法和內(nèi)毒素檢測方法。如果在處理過程中運用了激烈的處理條件或溶劑，還應證明采用方法不會破壞或者減少藥品中細菌內(nèi)毒素含量，并且排除藥品pH、鹽濃度（推薦等滲環(huán)境）、溫度（一般不超過40℃）或β-葡聚糖等因素的干擾。

 

如何排除pH的干擾呢？假設藥品X的pH為3.90，一般而言供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0-8.0的范圍內(nèi)最為適宜。我們可以使用Tris緩沖液作為稀釋液，通過1M氫氧化鈉溶液來調(diào)節(jié)藥品的pH。當然1M氫氧化鈉和Tris緩沖液應該在已去除內(nèi)毒素的容器中配制，且不含內(nèi)毒素和干擾因子。

 

 4. 鱟試劑靈敏度復核試驗：選擇并確認鱟試劑使用規(guī)格，按照藥典或者廠家說明書要求制備細菌內(nèi)毒標準品，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ 4個濃度的內(nèi)毒素標準液，取不同濃度的內(nèi)毒素標準液分別與等體積的鱟試劑溶液（T）混合，每個內(nèi)毒素濃度平行做4管，另取2管加入等體積的細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）作陰性對照，根據(jù)下表進行加樣處理。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

 

 

判斷方法  將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫為陰性。

 

接受標準  當最低濃度管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的集合平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc），

 

 

式中：X為反應終點濃度（指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度）的對照值（lg）；n為每個濃度的平行管；

 

當λc在0.5λ-2λ（包括0.5λ、2λ）。方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度為該批次鱟試劑的靈敏度。

 

 5. 方法學驗證試驗：

 

1） 預干擾實驗：預干擾試驗目的是初步確認最小不干擾的藥品稀釋濃度（NIC），為正式干擾試驗提供適當藥品稀釋濃度依據(jù)。預干擾試驗對一系列藥品X的稀釋液進行試驗，在每一個稀釋濃度都有一組添加內(nèi)毒素的供試品溶液和一組不添加內(nèi)毒素的供試品溶液，供試品濃度可逐級稀釋，但最終供試品的稀釋倍數(shù)不超過MVD。根據(jù)下表制備。

 

 

2） 干擾試驗：按照下表制備A、B、C、D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液。

 

 

接受標準  只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管均為陰性，并且系列溶液C的結果復核鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗方有效。

 

結果判斷  當系列溶液B的結果復核鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為在該濃度下的供試品溶液無干擾作用。其他情況則認為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。

 

 6. 凝膠限度試驗方法確認：撰寫方法學驗證試驗報告，并且對藥品X的細菌內(nèi)毒素檢查完成日常檢測與質(zhì)控的SOP，其內(nèi)容一般包含樣品處理步驟、鱟試劑復溶方法、孵育時間、溫度控制、結果判斷標準等。具體加樣方式可參照下表來制備溶液A、B、C、D。其中使用稀釋倍數(shù)不超過MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液。

 

 

 

結果判斷  在37℃±1℃恒溫器中保溫60分鐘±2分鐘后觀察其結果（判斷方法與鱟試劑靈敏度復核試驗一致）。若陰性對照均為陰性，陽性對照管和供試品陽性對照管均為陽性，試驗方有效。若供試品兩個平行管均為陰性，則判斷供試品合格。若供試品兩個平行管均為陽性，則判定不符合規(guī)定。若供試品兩個平行管一管為陽性、一管為陰性，則需要進行復試。復試時供試品溶液C需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，則判定供試品符合規(guī)定，否則判定不符合規(guī)定。

 

參考文件：

 

1. 2020版《中國藥典》

 

2. 2025版《中國藥典》

 

3. [醫(yī)藥]細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立、限值的確定 - 豆丁網(wǎng)