單抗源于體液免疫的生物學(xué)機(jī)制，已成為診斷和治療多種疾病的多樣化、快速增長(zhǎng)的療法。2022年超250種抗體進(jìn)入臨床研究，2024年全球銷售額前10的藥物中至少一半為抗體?？贵w藥物研發(fā)的一個(gè)核心挑戰(zhàn)是，早期開(kāi)發(fā)階段需深度表征抗體的生物學(xué)特性，如親和力，以選擇最適合臨床需求的候選抗體。
抗體由2個(gè)Fab（抗原結(jié)合域）和1個(gè)Fc（可結(jié)晶片段）組成。Fab含互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs），通過(guò)非共價(jià)結(jié)合識(shí)別抗原。Fc結(jié)合Fc受體（FcγRs），觸發(fā)免疫效應(yīng)（如ADCC/ADCP）。此外，還有一些新型設(shè)計(jì)，如雙抗、ADC、免疫細(xì)胞因子融合物等。不同IgG亞型對(duì)FcγR的親和力不同，影響效應(yīng)功能?？赏ㄟ^(guò)一些策略進(jìn)行改造，比如糖工程（如去巖藻糖基化）增強(qiáng)ADCC；序列或鉸鏈區(qū)工程調(diào)節(jié)Fc柔性或取向；通過(guò)抗原結(jié)合引發(fā)的變構(gòu)效應(yīng)，間接調(diào)控Fc受體結(jié)合。另外，靶點(diǎn)類型也具備一定的多樣性，既有可溶性抗原（細(xì)胞因子、激素），也有膜蛋白（受體、信號(hào)分子）?？贵w可以通過(guò)阻斷配體-受體復(fù)合物發(fā)揮作用，也可以通過(guò)FcγR激活效應(yīng)細(xì)胞（如NK細(xì)胞）清除靶細(xì)胞，又可模擬多價(jià)配體誘導(dǎo)受體聚集（如激活免疫信號(hào)）?？贵w親和力并非越高越好，需綜合評(píng)估親和力與功能的關(guān)系。本文圍繞抗體親和力這一話題展開(kāi)討論。
首先需要區(qū)分一個(gè)概念親和力（Affinity）和親合力（Avidity）。
親和力（Affinity）指抗體與抗原的“結(jié)合強(qiáng)度”，反映抗體與抗原之間的結(jié)合緊密程度，由結(jié)合速率（kon）與解離速率（koff）共同決定，單位為平衡解離常數(shù)（KD=koff/kon）。主要描述CDR與抗原表位之間的相互作用，作用強(qiáng)度依賴非共價(jià)作用力，如氫鍵、范德華力、靜電作用等。
親合力（Avidity）指抗體雙價(jià)結(jié)合帶來(lái)的“整體親和力”，由于天然抗體為雙價(jià)結(jié)構(gòu)，可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原，這種協(xié)同效應(yīng)稱為親合力（Avidity），可表現(xiàn)為表觀親和力增強(qiáng)?？贵w兩個(gè)Fab臂結(jié)合鄰近表位（如細(xì)胞膜上重復(fù)抗原），需同時(shí)解離才能釋放抗體，顯著延長(zhǎng)解離半衰期。對(duì)于膜抗原，抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合后，局部抗體有效濃度升高，第二結(jié)合事件更易發(fā)生，依賴于細(xì)胞密度與抗原表達(dá)水平。
下表總結(jié)了兩個(gè)概念的區(qū)別。
調(diào)節(jié)抗體-抗原結(jié)合的策略
序列改造調(diào)節(jié)抗體親和力
可以利用體外篩選與人工親和力成熟技術(shù)平臺(tái)，如噬菌體/酵母/哺乳動(dòng)物展示系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。大致流程是，先構(gòu)建天然抗體文庫(kù)，后通過(guò)PCR隨機(jī)突變或定點(diǎn)突變生成突變庫(kù)，再通過(guò)多輪篩選逐步提升親和力。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是無(wú)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理問(wèn)題，且可精確控制親和力范圍。
也可以利用體內(nèi)親和力成熟技術(shù)路徑，如免疫動(dòng)物（如表達(dá)人源抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠）后，從記憶B細(xì)胞/漿細(xì)胞中篩選高親和力抗體。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是可生成天然構(gòu)象、高親和力且臨床轉(zhuǎn)化潛力高的抗體。缺點(diǎn)是親和力調(diào)控精度低于體外方法。
隨著技術(shù)的發(fā)展，下一代測(cè)序（NGS）與AI/ML的協(xié)同應(yīng)用在抗體親和力改造方面也有一定價(jià)值，并可能是未來(lái)發(fā)展的重要方向之一。NGS可大規(guī)模獲取抗體編碼核酸序列，若已有大量抗體序列及其結(jié)合數(shù)據(jù)，進(jìn)行AI模型訓(xùn)練，AI/ML可用于預(yù)測(cè)高親和力序列，設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)以優(yōu)化親和力，或從頭設(shè)計(jì)抗體（denovo design），僅基于靶點(diǎn)信息構(gòu)建高親和力抗體。目前已經(jīng)有一些數(shù)據(jù)庫(kù)和資源支持以上操作，如序列數(shù)據(jù)庫(kù)OAS（Observed Antibody Space）和PLAb Dab（Patent and Literature Antibody Database）；結(jié)構(gòu)/親和力數(shù)據(jù)庫(kù)SKEMPI、CATH、HER2結(jié)合數(shù)據(jù)集等。不過(guò)，截至目前，尚未有經(jīng)AI/ML設(shè)計(jì)的抗體進(jìn)入臨床。
通過(guò)結(jié)構(gòu)工程提升抗體靶點(diǎn)結(jié)合效率
除通過(guò)改造序列，“提高親和力”外，還可通過(guò)改造抗體結(jié)構(gòu)（如雙特異、多特異、附加功能域）來(lái)增強(qiáng)結(jié)合效率。
雙特異性抗體（bsAbs）指一條抗體分子含兩個(gè)不同F(xiàn)ab，可同時(shí)識(shí)別兩個(gè)抗原或一個(gè)抗原上的兩個(gè)表位。作用模式分為cis和trans兩種。Cis結(jié)合的兩個(gè)靶標(biāo)位于同一細(xì)胞。這類分子可以通過(guò)“雙抗原共表達(dá)”提高選擇性，減少對(duì)單陽(yáng)性細(xì)胞的“on-target/off-tumor”毒性。需精細(xì)調(diào)節(jié)每個(gè)臂的親和力，若某臂親和力過(guò)高，可因單價(jià)結(jié)合而喪失雙價(jià)優(yōu)勢(shì)。Trans結(jié)合指兩個(gè)靶標(biāo)位于不同細(xì)胞。經(jīng)典案例包括免疫細(xì)胞重定向（如TAA×CD3 T-cell engager，或TAA×CD16A NK-cell engager）。
有雙抗，自然有三特異性抗體（trispecifics）。多抗既可以靶向不同抗原，也可以結(jié)合同一抗原不同表位，如雙表位抗體（biparatopic Abs），比如對(duì)于ADC藥物，可以促進(jìn)受體聚集、內(nèi)化、溶酶體降解，提升ADC的毒素遞送效率。
提到表位（epitope），又分為“功能性表位”和“非功能性表位”。功能性表位被結(jié)合后可阻斷配體、招募免疫細(xì)胞、促進(jìn)ADC內(nèi)化等。非功能性表位屬于即使被高親和力抗體結(jié)合，也不產(chǎn)生治療收益。所以，高親和力≠高療效，應(yīng)優(yōu)先靶向關(guān)鍵功能殘基或最佳免疫取向的表位。
抗原-抗體相互作用檢測(cè)
抗體親和力的測(cè)量需根據(jù)靶點(diǎn)特性和結(jié)合復(fù)雜性選擇合適技術(shù)，避免因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)不當(dāng)而誤解靶點(diǎn)結(jié)合能力。常用技術(shù)分為兩類：固定配體類（如SPR、BLI）、活細(xì)胞結(jié)合類（如流式細(xì)胞術(shù)、KinExA）
表面等離子共振（SPR）
原理：將抗原或抗體固定在金屬芯片表面，實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)合/解離導(dǎo)致的光學(xué)折射率變化，計(jì)算結(jié)合速率（Kon）與解離速率（Koff），得出KD值。
優(yōu)點(diǎn)：高通量、無(wú)標(biāo)記；可測(cè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)
局限性包括：1）生理相關(guān)性差：固定抗原可能喪失天然構(gòu)象，無(wú)法模擬細(xì)胞膜環(huán)境；2）多價(jià)結(jié)合干擾：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需抑制avidity（如通過(guò)低密度固定）；3）緩沖條件與體內(nèi)差異大（pH、離子強(qiáng)度等）；4）超慢解離難測(cè)：需長(zhǎng)時(shí)間洗脫，KD通常僅能測(cè)至低皮摩爾級(jí)。
活細(xì)胞結(jié)合技術(shù)：流式細(xì)胞術(shù)
原理：用不同濃度熒光標(biāo)記抗體結(jié)合表達(dá)靶抗原的細(xì)胞，通過(guò)熒光強(qiáng)度計(jì)算半數(shù)結(jié)合濃度（EC50）和最大結(jié)合（Bmax）。
優(yōu)點(diǎn)：保留抗原天然構(gòu)象和膜環(huán)境，適合模擬生理狀態(tài)；可檢測(cè)抗體二價(jià)結(jié)合導(dǎo)致的avidity效應(yīng)（如EC50降低但Bmax減少）。
局限性包括：1）EC50≠KD：高抗原表達(dá)或avidity會(huì)扭曲EC50與真實(shí)親和力的關(guān)系；2）假陰性風(fēng)險(xiǎn)：抗原-抗體內(nèi)吞或細(xì)胞表面抗原脫落會(huì)降低信號(hào)，需低溫或固定細(xì)胞緩解，但可能降低生理相關(guān)性；3）需與動(dòng)力學(xué)技術(shù)（如Ligand Tracer）聯(lián)用以確認(rèn)平衡狀態(tài)。
KinExA（動(dòng)力學(xué)排阻法）
原理：KinExA是一種基于溶液的親和力測(cè)定技術(shù)，不固定任何分子，維持抗原抗體在天然狀態(tài)下的平衡。將不同濃度的抗原與恒定濃度的抗體孵育至平衡，然后將混合物通過(guò)包被抗原的微珠，在極短時(shí)間（<0.5秒）內(nèi)捕獲游離抗體，再用熒光二抗檢測(cè)，從而推算出游離抗體濃度，計(jì)算KD值。
優(yōu)點(diǎn)：1）生理相關(guān)性強(qiáng)：無(wú)需固定，保留抗原天然構(gòu)象；2）適用范圍廣：可用于膜蛋白、完整細(xì)胞、未純化樣品；3）高靈敏度：可測(cè)至fM級(jí)別；
局限性包括：1）通量較低：一次只能測(cè)一個(gè)樣品；2）背景干擾：血清中內(nèi)源性IgG可能產(chǎn)生非特異信號(hào)。
單細(xì)胞相互作用細(xì)胞術(shù)（scIC/RT-IC）
原理：將表達(dá)抗原的活細(xì)胞固定在微流控“籠”中，熒光標(biāo)記抗體在流動(dòng)中通過(guò)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體結(jié)合與解離，記錄保留時(shí)間和熒光強(qiáng)度，評(píng)估affinity與avidity。
優(yōu)點(diǎn)：1）真實(shí)細(xì)胞環(huán)境：抗原處于天然膜狀態(tài)；2）可測(cè)avidity：適合二價(jià)或多價(jià)抗體；3）動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：可觀察親和力成熟后的變化。
缺點(diǎn)是技術(shù)門檻高，設(shè)備復(fù)雜，尚未普及。
功能藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)用于親和力測(cè)定
原理：當(dāng)抗體作為拮抗劑阻斷受體-配體結(jié)合時(shí)，可通過(guò)劑量依賴性抑制曲線估算其親和力。
方法包括：1）Cheng-Prus off修正：適用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但需確認(rèn)非“tight-binding”系統(tǒng)；2）Schild分析：更嚴(yán)謹(jǐn)，適用于高親和力抗體，可判斷是否真正為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。
用于親和力測(cè)定的各種方法的范式、優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)和檢測(cè)范圍如下表所示。
靶點(diǎn)介導(dǎo)的藥物處置（TMDD）
在某些情況下，可溶性靶抗原的大小和功能會(huì)決定抗原/抗體復(fù)合物的消除速率，這一現(xiàn)象被稱為靶點(diǎn)介導(dǎo)的藥物處置（TMDD）。一個(gè)典型例子是靶向PCSK9的抗體，其整體動(dòng)力學(xué)呈非線性，消除半衰期較短。通過(guò)改造CDR，使抗體在內(nèi)涵體pH6.0時(shí)親和力降低，可讓抗體在內(nèi)涵體中與靶抗原解離并被細(xì)胞釋放，從而改變PCSK9的藥代動(dòng)力學(xué)特征。目前已有多種抗體通過(guò)“pH開(kāi)關(guān)”機(jī)制設(shè)計(jì)改善PK。
膜結(jié)合靶標(biāo)也可能出現(xiàn)TMDD：靶抗原可能自然內(nèi)化，或在與抗體結(jié)合后被誘導(dǎo)內(nèi)化。其對(duì)抗體的影響取決于全身抗原表達(dá)量與抗體劑量的比例，以及抗體-抗原復(fù)合物的內(nèi)化速率。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，復(fù)合物內(nèi)化會(huì)形成非線性清除途徑，其中清除速率與抗原表達(dá)量、內(nèi)化速率、抗原/抗體親和力相關(guān)。這可能降低細(xì)胞膜上的靶標(biāo)占有率，對(duì)于ADC類藥物可能是件好事，對(duì)于需要阻斷靶點(diǎn)通路或依賴ADCC發(fā)揮作用的抗體則不利。
抗體分布
抗體親和力會(huì)影響其組織分布及到達(dá)靶部位的有效性。例如，“結(jié)合位點(diǎn)屏障假說(shuō)”（binding site barrier hypothesis）指出，高親和力抗體難以穿透實(shí)體腫瘤，因?yàn)樗鼈儠?huì)被困在腫瘤外層抗原密集區(qū)域。此觀點(diǎn)還認(rèn)為高親和力抗體會(huì)呈現(xiàn)出不同的分布特征。
抗體與抗原的相互作用可用于改善治療性抗體的組織分布。一個(gè)顯著案例是“腦穿梭”（brain shuttling）技術(shù)，該技術(shù)能增強(qiáng)抗體對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穿透性。其原理是通過(guò)基因工程讓抗體包含一個(gè)結(jié)合域，該結(jié)合域可與介導(dǎo)內(nèi)源性配體轉(zhuǎn)胞吞作用的受體結(jié)合，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是最常用的靶點(diǎn)。此類策略可能顯著改善阿爾茨海默病等疾病的治療效果。
鉤狀效應(yīng)（Hook effect）
“過(guò)度擁擠”（Overcrowding）或“自身抑制”（auto-inhibition）是多價(jià)、多功能分子的一種特性，可能導(dǎo)致“鉤狀效應(yīng)”——即藥物濃度過(guò)高時(shí)療效反而下降，這在體外實(shí)驗(yàn)中常用于蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）的研究。在高濃度下，分子會(huì)與任一靶標(biāo)形成二元復(fù)合物，從而阻礙功能性活性三元復(fù)合物的后續(xù)形成。這一現(xiàn)象在抗體依賴的ADCC以及T細(xì)胞和NK細(xì)胞銜接子中也需加以考慮。這種雙相濃度-效應(yīng)曲線的形態(tài)取決于抗原的親和力和表達(dá)量，因此適合通過(guò)基于數(shù)學(xué)模型的方法進(jìn)行優(yōu)化。
另外，雙抗對(duì)兩種可溶性靶標(biāo)均為單價(jià)，且可假設(shè)其兩個(gè)臂的結(jié)合是相互獨(dú)立的。這意味著，在給定抗體劑量下，針對(duì)某一靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量相較于其單特異性親本抗體減少一半。因此，雙抗的有效劑量應(yīng)為其來(lái)源的兩種二價(jià)“親本”抗體中較高者的兩倍。
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